במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע
Summary
Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.
Abstract
Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.
Introduction
וירוס שפעת A (IAV) הוא וירוס אפוף ושייך למשפחת Orthomyxoviridae. הגנים שלו מקודדים על גנום RNA מפולח, שלילי-השכל חד-גדילים. אצל בני אדם, IAV גורם זיהומים בדרכי נשימה, אשר מתרחשים התפרצויות מגיפה עונתיות ונושאת פוטנציאל המגיפות העולמיות 1. עם קשירת שאריות חומצת sialic על תא מארח המשטח 2, IAV מופנם על ידי אנדוציטוזה clathrin התלוי מסלולים עצמאיים-clathrin 3-8. המילייה חומצי (pH <5.5) ב vacuoles endocytic מפעילה שינוי קונפורמציה מרכזי hemagglutinin גליקופרוטאין ספייק IAV (HA), שתוצאתה היתוך של נגיפי ואת endosomal מאוחר קרום 9. לאחר קפסיד IAV (כאן המכונה גם ויראלי "הליבה") ברח מן endosomes מאוחר (LES), הוא ללא ציפוי ב cytosol ואחריו התחבורה של ribonucleoproteins ויראלי (vRNPs) לתוך הגרעין – O את האתרf וירוס שכפול שעתוק 10-13. לפני הפעלת חומצה של HA בנגיף חווה ירידה הדרגתית pH במערכת endocytic, אשר מספרים ראשוניים הליבה עבור פירוקו לאחר 14-16. בחודש זה "הטרמה" צעד של תעלות יונים M2 בקרום ויראלי לתווך זרם של פרוטונים ו- K +10,14,16. השינוי בריכוז יוני בפנים הווירוס מפריע האינטראקציות להצטבר על ידי חלבון מטריקס ויראלי M1 ואת צרור השמונה vRNP, ומקל IAV uncoating בציטופלסמה הבא קרום היתוך 10,14-17.
ניתוח ישיר וכמותיים של הצעד יחול כבר הקשה על ידי העובדה endosomes קשה לגשת באופן ניסיוני. תהליך הכניסה, יתר על כן, מאוד לא סינכרוני. בנוסף, מבחני סוף נקודות, כגון qRT-PCR של מדידות infectivity או רנ"א נגיפי שוחרר, אינם מספקים תמונה מפורטת על מצב ביוכימי של capsi ויראליד בכל צעד נתון כניסה. בעוד ההפרעות של endosomes ידי siRNA או טיפול תרופתי תרם משמעותית להבנת כניסה IAV 18-20, כיוונון עדין קשה ונוטים תופעות לוואי נוקבים בתוכנית התבגרות אנדוזום תחת פיקוח הדוק.
כדי למנוע בעיות אלה, יש לנו התאמנו שפותח בעבר בפרוטוקול במבחנה מבוסס על שימוש צנטריפוגה שיפוע מהיר 17. בניגוד לניסיונות אחרים 21,22, 23,24, שהתבססו בעיקר על שילובים של מחשוף פרוטאוליטים וטיפול חומר ניקוי ואחריו ניתוח EM, גישה זו אפשרה להם תוצאה לכימות בקלות. צנטריפוגה דרך שכבות צבע שונות מאפשרת החלקיקים לסדימנטציה להיחשף ומגיבים עם שינוי תנאים באופן מבוקר. בפרוטוקול שהוצג, IAV נגזר נוזל allantoic בהיר או חלקיקים נגיפיים מטוהרים שקועים גליצרול דו שכבתישיפוע שבו השכבה התחתונה מכילה את הלא יוניים חומר ניקוי NP-40 (איור 1). כמו הנגיף חודר את השכבה השנייה, המכיל חומר ניקוי, המעטפה שומנים ויראלי גליקופרוטאינים המעטפה הם solubilized בעדינות והשאיר אחריו. הליבה, מורכב משמונה צרור vRNP ומוקף שכבת מטריקס, משקע כמבנה יציב לתוך השבר הגלול. חלבונים הליבה ויראלי, כגון M1 ו- nucleoprotein הקשורים vRNP (NP), יכול להיות מזוהים את הכדור על ידי SDS-PAGE ו Coomassie מכתים. בפרט, תוך ניצול של ג'ל שיפוע הזמין המסחרי מכתימה עם קולואידים רגישות הגבוהה Coomassie 25, מאפשר דיוק וזיהוי גבוהים של כמויות קטנות אפילו של חלבוני ליבה קשורה ויראלי.
זו מגדירה את הבסיס לבדוק האם תנאים שונים כגון pH, ריכוז מלח, וגורם uncoating המשוערת יש השפעות על התנהגות השקיעה של רכיבי ליבת הליבה stabil ity. למטרה זו, רק את השכבה התחתונה, המכיל חומר ניקוי שיפוע גליצרול היא שונה על ידי החדרת הגורם או מצב עניינים. הטכניקה כבר יקרה במיוחד בחקירת ההשפעה שונה ערכי pH וריכוז מלח על שלמות ליבת IAV 16. פעולות ביניים של uncoating IAV יכול להיות במעקב דיסוציאציה כולל של שכבת מטריקס ב- pH חומצי קל (<6.5) ואחריו דיסוציאציה vRNP ב- pH 5.5 והתחתון 16,17 (איור 1). השלב האחרון היה עוד יותר משופר על ידי נוכחות של גבוה K + ריכוז בשכבת גליצרול, המשקף בסביבה endocytic מאוחר 16. לכן, כמו הווירוס ואת הליבה משקעים דרך השיפוע שחווה בסביבה משתנית שתנאים מחקו ב endosomes. התוצאה היתה פירוק הדרגתי של הליבה ויראלי במבחנה, המשלימה התוצאות הנגזרות מבחני ביולוגיה של התא.
t "> השיטה המוצגת כאן אפשרה מהר וניתוח לשחזור ביותר של IAV (X31 ו- A / WSN / 33) ואת IBV (B / Lee / 40) uncoating מופעלות על ידי pH חומצי והגדלת K +16,17 וכן פירוק ליבות paramyxovirus בחשיפה pH בסיסי 17. זה מתקבל על הדעת כי ניתן להתאים את הגישה וירוסים אפוף אחרים כדי להשיג תובנות את התכונות הביוכימיות של המבנה קפסיד ויראלי ופירוק קפסיד במהלך ערך בתא.Protocol
Representative Results
Discussion
capsids ויראלי הם קומפלקסים macromolecular metastable. בעוד הרכבה של virions מחייבת encapsidation ועיבוי של הגנום הווירוס, ייזום של הסיבוב הבא של זיהום תלוי פירוק מבנה קפסיד קומפקטי זו. וירוסים התפתחו לנצל מנגנונים תאיים שונים כדי לשלוט על מחזור הציפוי-uncoating, כולל קולטני תאים, מלווה, אנזימים פ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים יוהיי Yamauchi ורוברטה מנצ'יני לספק לנו חומרים כימיים. מעבדת AH נתמכה על ידי רשתות ההדרכה הראשוניות מארי קירי (ITN), מועצת המחקר האירופית (ERC), ועל ידי הקרן הלאומית למדע השויצרי (Sinergia).
Materials
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE® LDS sample buffer (4X) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop™ filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4°C |
References
- Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
- de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
- Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
- Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
- White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
- Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
- Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. Chapter 47. Fields Virology. , 1647-1690 (2006).
- Chou, Y. -. Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).
- Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
- Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
- Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
- Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
- Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
- Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
- Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
- Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).
- Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
- Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
- Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
- Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
- Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
- Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
- Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).
