Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.
Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.
Influenza A-virus (IAV) er et kappebærende virus og hører til familien af Orthomyxoviridae. Dets gener er kodet på et segmenteret negativ-sense og enkeltstrenget RNA-genom. Hos mennesker IAV forårsager luftvejsinfektioner, som opstår i årstidens udbrud af epidemier og bærer risikoen for globale pandemier 1. Efter binding til sialinsyrerester på værtscellens overflade 2, er IAV internaliseret af clathrin-afhængig endocytose og clathrin-uafhængige veje 3-8. Den sure miljø (pH <5,5) i de endocytiske vakuoler udløser en større konformationel ændring i IAV spike glycoprotein hemagglutinin (HA), hvilket resulterer i fusion af den virale og den sene endosomale membran 9. Når IAV capsidet (her også omtalt som viral "kerne") er undsluppet fra sent endosomer (LES), er det uovertrukne i cytosolen efterfulgt af transport af de virale ribonucleoproteiner (vRNPs) ind i kernen – sitet of virus replikation og transkription 10-13. Forud for syre aktivering af HA virussen oplever et gradvist fald i pH i endocytiske system, som primtal kernen for den efterfølgende demontering 14-16. I denne "priming" step M2 ionkanaler i den virale membran mægle tilstrømningen af protoner og K +10,14,16. Ændringen i ionkoncentration i virusset indre forstyrrer interaktionerne opbygget af det virale matrixprotein M1 og vRNP bundtet otte, og letter IAV uncoating i cytoplasmaet efter membranfusion 10,14-17.
Direkte og kvantitativ analyse af priming skridt er hæmmet af, at endosomer er vanskelige at få adgang til eksperimentelt. Punktet proces er i øvrigt særdeles ikke-synkron. Hertil kommer, at end-point assays, såsom QRT-PCR af frigivne virale RNA eller infektivitet målinger, ikke give et detaljeret billede om den biokemiske tilstand virale capsid på ethvert givet trin med post. Mens forstyrrelse af endosomer med siRNA eller lægemiddelbehandling har bidraget væsentligt til forståelsen af IAV post 18-20, finjustering er vanskelig og udsat for uspecifikke bivirkninger i tæt kontrolleret endosomet modning program.
For at undgå disse problemer har vi tilpasset en tidligere udviklet in vitro protokol baseret på anvendelsen af hastigheden gradientcentrifugering 17. I modsætning til andre forsøg 21,22, 23,24, som for det meste var baseret på kombinationer af proteolytisk spaltning og rengøringsmiddel behandling efterfulgt af EM analyse, denne tilgang aktiveret en let kvantificerbare resultat. Centrifugering gennem forskellige gradient lag tillader sedimenterende partikler, der skal udsættes for og reagerer med skiftende betingelser på en kontrolleret måde. I det præsenterede protokol, IAV afledt fra klaret allantoisvæske eller oprensede viruspartikler bundfældes i en to-lags glycerolgradient, hvor det nederste lag indeholder den ikke-ionisk detergent NP-40 (figur 1). Da virus ind i andet detergent-holdige lag, er de virale lipidkappe og kappeglycoproteiner forsigtigt solubiliseret og efterladt. Kernen, der består af de otte vRNP bundt og omgivet af en matrix lag, sedimenter som en stabil struktur i pelletfraktionen. Virale kerneproteiner, såsom M1 og vRNP-associeret nukleoprotein (NP), kan identificeres i pelleten ved SDS-PAGE og Coomassie-farvning. Især udnytter kommercielt tilgængelige gradientgeler og farvning med den meget følsomme kolloidt Coomassie 25, muliggør stor præcision og detektering af selv små mængder af virale kerne-associerede proteiner.
Dette sætter grundlaget for at teste, om forskellige forhold, såsom pH, saltkoncentration, og formodede overtrækkende faktorer har virkninger på sedimentering adfærd kernekomponenter og core stabil tet. Til dette formål er kun den nederste, detergent-indeholdende lag i glycerolgradient modificeret ved indføring faktoren eller tilstand af interesse. Teknikken har været særligt værdifulde undersøge virkningen af forskellige pH-værdier og saltkoncentrationer på integriteten af IAV kerne 16. Mellemliggende trin af IAV uncoating kunne overvåges herunder dissociering af matrixlaget ved mildt sur pH (<6,5) efterfulgt af vRNP dissociation ved pH 5,5 og lavere 16,17 (figur 1). Det sidstnævnte trin blev yderligere forstærket af tilstedeværelsen af høj K + koncentration i glycerol lag, hvilket afspejler en sen endocytiske miljø 16. , Idet virus og kernen sedimenterede gennem gradienten oplevede de således en skiftende miljø, som efterligner tilstande i endosomer. Resultatet var en trinvis adskillelse af den virale kerne in vitro, der supplerer resultater stammer fra cellebiologiske assays.
t "> Metoden præsenteres her har muliggjort hurtig og meget reproducerbar analyse af IAV (X31 og A / WSN / 33) og IBV (B / Lee / 40) overtrækkende udløst ved sur pH og stigende K +16,17 samt demontering af paramyxo kerner upon alkalisk pH eksponering 17. det er tænkeligt, at denne metode kan tilpasses andre indkapslede vira at få indblik i de biokemiske egenskaber af det virale capsid struktur og capsid demontering under celleindtrængning.Virale capsider er metastabile makromolekylære komplekser. Mens samlingen af virioner kræver indkapsling og kondensation af virusgenomet, initiering af den næste runde af infektion afhænger demontering af denne kompakte capsid struktur. Vira har udviklet sig til at udnytte forskellige cellulære mekanismer til at kontrollere belægningen-uncoating cyklus, herunder cellulære receptorer, chaperoner, proteolytiske enzymer, fysiske kræfter leveret af motordrevne proteiner eller helicaser samt pH og ioniske omski…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Yohei Yamauchi og Roberta Mancini til at forsyne os med reagenser. Den AH laboratorium blev støttet af Marie Curie Initial Training Networks (ITN), Det Europæiske Forskningsråd (ERC), og af den schweiziske National Science Foundation (Sinergia).
cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
NuPAGE® LDS sample buffer (4X) | Life Technologies | NP0008 | |
NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X) | Life Technologies | NP0001 | |
pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
Steritop™ filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4°C |