In Vitro Demontage van influenza A-virus capsiden door gradiëntcentrifugatie

Summary

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Abstract

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

Introduction

Influenza A virus (IAV) is een omhuld virus en behoort tot de familie van Orthomyxoviridae. De genen worden gecodeerd op een gesegmenteerde negatieve-sense en enkelstrengs RNA genoom. Bij de mens, IAV veroorzaakt infecties van de luchtwegen, die voorkomen in seizoensgebonden epidemieën en draagt ​​het potentieel voor wereldwijde pandemieën ^1. Bij binding aan siaalzuur residuen van de gastheercel oppervlak ² wordt IAV geïnternaliseerd door clathrine-afhankelijke endocytose en clathrine-onafhankelijke routes ^3-8. De zure milieu (pH <5,5) in de endocytische vacuolen veroorzaakt een grote conformationele verandering in de iav spike glycoproteïne hemagglutinine (HA), waardoor fusie van de virale en endosomale membraan ⁹ late. Zodra de IAV capside (hier ook aangeduid als virale "kern") is ontsnapt uit late endosomen (GO) wordt onbekleed in het cytosol gevolgd door transport van de virale ribonucleoproteins (vRNPs) in de kern – de site of virus replicatie en transcriptie ^10-13. Vóór zure activatie van het virus HA ervaart een geleidelijke afname in pH in de endocytische systeem, waarbij de kern voor de latere demontage ^14-16 priemgetallen. In deze "priming" stap het M2 ionkanalen in het virale membraan bemiddelen de instroom van protonen en K ^+10,14,16. De verandering in ionische concentratie in het inwendige virus verstoort de interacties opgebouwd uit het virale eiwit matrix M1 en de acht vRNP bundel en vergemakkelijkt IAV ontmanteling in het cytoplasma volgende membraanfusie ^10,14-17.

Directe en kwantitatieve analyse van de priming stap belemmerd doordat endosomen moeilijk om experimenteel. De vermelding proces is bovendien zeer non-synchrone. Daarnaast hebben eindpunt assays, zoals qRT-PCR van viraal RNA of vrijgegeven besmettelijkheidsmetingen, geen gedetailleerd beeld over de biochemische status van de virale Capsi biedend op elk stap van binnenkomst. Terwijl de verstoring van endosomen door siRNA of behandeling met geneesmiddelen aanzienlijk heeft bijgedragen aan het begrip van IAV binnenkomst ^18-20, fine-tuning is moeilijk en gevoelig voor niet-specifieke bijwerkingen in de streng gecontroleerde endosoom rijping programma.

Om deze problemen te vermijden, hebben we een eerder ontwikkelde in vitro protocol gebaseerd op het gebruik van snelheidsgradiënt centrifugatie ¹⁷ aangepast. In tegenstelling tot andere pogingen ^{21,22, 23,24,} die meestal zijn gebaseerd op combinaties van proteolytische splitsing en detergens behandeling, gevolgd door EM-analyse, deze benadering mogelijk een gemakkelijk meetbaar resultaat. Centrifugatie door verschillende helling lagen kan de sedimenteren deeltjes worden blootgesteld aan en reageren met veranderende condities op een gecontroleerde manier. In de gepresenteerde protocol IAV afgeleid van geklaarde allantoïsvocht of gezuiverde virale deeltjes gesedimenteerd in een tweelaags glycerolgradiënt waarbij de onderlaag bevat de niet-ionische detergens NP-40 (figuur 1). Omdat het virus komt in de tweede, detergent bevattende laag, wordt de virale lipide-envelop en envelop glycoproteïnen langzaam oplosbaar en achtergelaten. De kern, bestaande uit de acht vRNP bundel en wordt omgeven door een matrix laag, sedimenten als een stabiele structuur in de fractie pellet. Virale kerneiwitten zoals M1 en vRNP geassocieerde nucleoproteïne (NP), kunnen worden geïdentificeerd in de pellet door SDS-PAGE en Coomassie kleuring. Met name te maken van commercieel beschikbare gradiënt gelen en kleuring met de zeer gevoelige colloïdale Coomassie ^25, maakt hoge precisie en detectie van zelfs kleine hoeveelheden virale kern geassocieerde eiwitten.

Dit stelt de basis voor testen of andere omstandigheden zoals pH, zoutconcentratie, en vermeende ontmanteling factoren hebben invloed op het sedimentatiegedrag van kernonderdelen en kern stabil teit. Hiertoe wordt alleen de onderste, detergent-bevattende laag in de glycerol gradiënt gemodificeerd door introductie van de factor of aandoening van belang. De techniek is bijzonder waardevol bij het ​​onderzoek het effect van verschillende pH en zoutconcentraties op de integriteit van de kern ¹⁶ IAV geweest. Tussenstappen van IAV uncoating kan worden gevolgd onder dissociatie van de matrixlaag bij mild zure pH (<6,5), gevolgd door dissociatie vRNP bij pH 5,5 en lager ^16,17 (Figuur 1). De laatste stap werd verder versterkt door de aanwezigheid van hoge K ⁺ -concentratie in de glycerollaag, als gevolg van een late endocytische omgeving ^16. Zoals de virus en de kern gesedimenteerd door de gradiënt ervaren ze een veranderende milieu dat bootst omstandigheden in endosomen. Het resultaat was een stapsgewijze demontage van de virale kern in vitro, als aanvulling op de resultaten afgeleid van celbiologie assays.

t "> De hier gepresenteerde methode is snel ingeschakeld en zeer reproduceerbare analyse van IAV (X31 en A / WSN / 33) en IBV (B / Lee / 40) ontmantelingsmechanisme veroorzaakt door zure pH en het verhogen van K ^+16,17 evenals demontage van paramyxovirus kernen bij alkalische pH blootstelling ^17. het is denkbaar dat de benadering kan worden aangepast aan andere omhulde virussen inzichten in de biochemische eigenschappen van het virale capside structuur en capside demontage groeit tijdens celinvoer.

Protocol

1. Bereiding van Buffers en Voorraadoplossingen Bereid MNT buffer (20 mM MES, 30 mM Tris en 100 mM NaCl) door het oplossen van 470 mg Tris HCl, 390 mg MES-hydraat en 580 mg NaCl in 80 ml ​​DDH 2 O. Stel de buffer op pH 7,4 en brengen tot een eindvolume van 100 ml met DDH 2 O. Bereid drie identieke oplossingen van 500 mM MES buffer door het oplossen van 9,76 g MES hydrateren in 80 ml ​​dH 2 O per stuk. Stel de buffers op pH 5,8, 5,4 en 5,0, respectievelijk doo…

Representative Results

Zoals reeds besproken, priming in endosomen is nodig om de IAV kern uncoating bevoegd te maken. Protonering van de kern verzwakt interactie tussen M1 en vRNPs (uit het virale RNA, NP en de polymerasecomplex PB1 / PB2 / PA). Dit proces begint wanneer binnenkomende virus wordt blootgesteld aan een pH van 6,5 (of lager) begin endosomen (EE) en gaat door tot fuseert het virus bij ongeveer pH 5,0 les. Om de daling van de pH naboots…

Discussion

Virale capsiden zijn metastabiele macromoleculaire complexen. Tijdens de montage van de virionen inkapseling en condensatie van het virusgenoom vereist begin van de volgende ronde van infectie afhankelijk demontage van deze compacte capside structuur. Virussen zijn geëvolueerd om verschillende cellulaire mechanismen exploiteren om de coating-uncoating cyclus, zoals cellulaire receptoren, chaperones, proteolytische enzymen, fysische krachten door motor eiwitten of helicasen en pH en ionische schakelaars ^26,27…

Materials

cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets	Sigma-Aldrich	11873580001	The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks
Glacial acetic acid	Merck Millipore	100063
Glycerol anhydrous BioChemica	AppliChem	A1123
Hydrochloric acid	Merck Millipore	100317
Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end)
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M8250
Methanol	Merck Millipore	106009
NP-40	Sigma-Aldrich	I8896	Now commercially available as IGEPAL® CA-630
NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm	Life Technologies	NP0321
NuPAGE® LDS sample buffer (4X)	Life Technologies	NP0008
NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X)	Life Technologies	NP0001
pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0	Merck Millipore	109542
QC Colloidal Coomassie Stain	BIO RAD	1610803
Sodium chloride	Merck Millipore	106406
Sodiumhydroxide	Merck Millipore	106498
Steritop™ filter unit	Merck Millipore	SCGPT05RE
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set	Beckman Coulter	331336
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Tris hydrochloride	AppliChem	A1087
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid	Virapur		Freshly thawed on 4°C