In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

Summary

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Abstract

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

Introduction

Le virus grippal A (IAV) est un virus enveloppé et appartient à la famille des Orthomyxoviridae. Ses gènes sont codés sur une, de sens négatif, segmenté et de génome à ARN simple brin. Chez l' homme, l' IAV provoque des infections respiratoires, qui se produisent dans les flambées épidémiques saisonnières et porte le potentiel de pandémies mondiales ^1. Lors de la liaison à des résidus d'acide sialique sur la surface de la cellule hôte ^2, IAV est internalisée par endocytose dépendante de la clathrine et indépendante de la clathrine voies ^3-8. Le milieu acide (pH <5,5) dans les vacuoles d' endocytose déclenche un changement conformationnel dans la majeure IAV pic glycoprotéine hémagglutinine (HA), qui se traduit par la fusion du virus et la fin de la membrane endosomique ^9. Une fois que la capside IAV (ici aussi appelé "core" virale) a échappé de endosomes tardifs (les), il est non couché dans le cytosol suivi par le transport des ribonucléoprotéines virales (vRNPs) dans le noyau – le site ola réplication virale et la transcription f ^13/10. Avant l'activation de l' acide de HA du virus subit une diminution progressive du pH dans le système d'endocytose, ce qui amorce le noyau pour son démontage ultérieur ^14-16. Dans ce "amorçage" étape les canaux ioniques M2 dans la membrane virale médier l'afflux de protons et K ^+10,14,16. La variation de la concentration ionique à l'intérieur du virus perturbe les interactions accumulent par la protéine virale de la matrice M1 et les huit vRNP faisceau, et facilite IAV déshabillage dans le cytoplasme suivant la fusion membranaire ^10,14-17.

analyse directe et quantitative de l'étape d'amorçage a été entravée par le fait que les endosomes sont difficiles d'accès expérimentalement. Le processus d'entrée est, par ailleurs, fortement non-synchrone. En outre, point final des essais, tels que qRT-PCR d'ARN ou d'infectivité virales mesures publiées, ne fournissent pas une image détaillée de l'état biochimique de la capsi viraled à une étape donnée d'entrée. Alors que la perturbation des endosomes par siRNA ou un traitement médicamenteux a contribué de manière significative à la compréhension de l' IAV entrée ^18-20, réglage fin est difficile et sujette à des effets secondaires non spécifiques dans le programme endosome de maturation étroitement contrôlé.

Pour éviter ces problèmes, nous avons adapté le protocole précédemment développé in vitro basée sur l'utilisation de la vitesse de centrifugation en gradient de ^17. Contrairement à d' autres tentatives ^{21,22, 23,24,} qui sont principalement basés sur des combinaisons de clivage protéolytique et un traitement détergent , suivi d' une analyse EM, cette approche a permis un résultat facilement quantifiables. Centrifugation à travers les différentes couches de gradient permet aux particules sédimentent à être exposée et réagissent avec les conditions changeantes de façon contrôlée. Dans le protocole présenté, IAV dérivé de liquide allantoïdien clarifié ou de particules virales purifiées sont sédimentées dans un glycérol à deux couchesgradient dans lequel la couche inférieure contient le détergent non ionique NP-40 (figure 1). Comme le virus pénètre dans la deuxième couche, contenant un détergent, l'enveloppe lipidique et glycoprotéines d'enveloppe virale sont doucement solubilisés et laissé derrière. Le noyau, composée de huit vRNP faisceau et entourés par une couche de matrice, des sédiments comme une structure stable dans la fraction de culot. protéines de nucléocapside virale, telles que M1 et nucléoprotéine vRNP associée (NP), peuvent être identifiés dans le culot par SDS-PAGE et une coloration de Coomassie. En particulier, en profitant de disponibles dans le commerce des gels de gradient et la coloration avec le colloïdale très sensible Coomassie ^25, permet une grande précision et la détection de petites quantités de protéines de base associées virales.

Ceci définit la base pour tester si des conditions différentes telles que le pH, la concentration en sel, et les facteurs déshabillage putatifs ont des effets sur le comportement de sédimentation des composants de base et le noyau stabil lité. A cet effet, seule la couche inférieure contenant un détergent dans le gradient de glycérol est modifiée par l'introduction d'un facteur ou d'une condition d'intérêt. La technique a été particulièrement utile pour étudier l'effet des différentes valeurs de pH et des concentrations de sel sur l'intégrité du noyau IAV ^16. IAV étapes intermédiaires de déshabillage pourraient être surveillées , y compris la dissociation de la couche de matrice à un pH légèrement acide (<6,5) , suivie par une dissociation vRNP à pH 5,5 et inférieure ^16,17 (figure 1). Cette dernière étape a été encore amélioré par la présence d' une forte concentration de K ⁺ dans la couche de glycérol, ce qui reflète un milieu endocytic retard ^16. Ainsi, comme le virus et le noyau sédimentés à travers le gradient ils ont connu un milieu changeant qui imite les conditions dans les endosomes. Le résultat était un démontage par étapes du noyau viral in vitro, en complément des résultats provenant de tests de biologie cellulaire.

t "> La méthode présentée ici a permis rapide et une analyse hautement reproductible des IAV (X31 et A / WSN / 33) et IBV (B / Lee / 40) déshabillage déclenchée par un pH acide et l' augmentation de K ^+16,17 ainsi que le démontage des noyaux paramyxovirus sur un pH alcalin exposition ^17. Il est concevable que l'approche peut être adaptée à d' autres virus enveloppés pour mieux comprendre les propriétés biochimiques de la structure de la capside virale et capside démontage lors de l' entrée de la cellule.

Protocol

1. Préparation de Tampons et Solutions mères Préparer tampon TMN (MES 20 mM, Tris 30 mM et NaCl 100 mM) en dissolvant 470 mg Tris Hydrochloride, 390 mg MES hydrate et 580 mg de NaCl dans 80 ml ​​ddH 2 O. Régler le tampon à pH 7,4 et l' amener à un volume final de 100 ml avec ddH 2 O. Préparer trois solutions identiques de tampon 500 mM MES en dissolvant 9,76 g MES hydrate dans 80 ml ​​dH 2 O chacun. Ajuster les tampons à pH 5,8, 5,4 et 5,0 respect…

Representative Results

Comme déjà discuté, l'amorçage dans les endosomes est nécessaire pour rendre le noyau IAV décapsidation compétente. Protonation du noyau affaiblit l'interaction de M1 et vRNPs (composé de l'ARN viral, NP, et la polymérase PB1 complexe / PB2 / PA). Ce processus est lancé lorsque le virus entrant est exposé à un pH de 6,5 (ou inférieur) au début des endosomes (SEE) et continue jusqu'à ce que les fusibles de virus à un pH d'environ 5,0 à LEs. <p clas…

Discussion

capsides virales sont des complexes macromoléculaires métastables. Alors que l'assemblage de virions nécessite l'encapsidation et la condensation du génome du virus, l'initiation du prochain cycle de l'infection dépend de démontage de cette structure de capside compact. Les virus ont évolué pour exploiter divers mécanismes cellulaires pour contrôler le cycle de revêtement décapsidation, y compris des récepteurs cellulaires, des chaperons, des enzymes protéolytiques, des forces physiques fou…

Materials

cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets	Sigma-Aldrich	11873580001	The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks
Glacial acetic acid	Merck Millipore	100063
Glycerol anhydrous BioChemica	AppliChem	A1123
Hydrochloric acid	Merck Millipore	100317
Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end)
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M8250
Methanol	Merck Millipore	106009
NP-40	Sigma-Aldrich	I8896	Now commercially available as IGEPAL® CA-630
NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm	Life Technologies	NP0321
NuPAGE® LDS sample buffer (4X)	Life Technologies	NP0008
NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X)	Life Technologies	NP0001
pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0	Merck Millipore	109542
QC Colloidal Coomassie Stain	BIO RAD	1610803
Sodium chloride	Merck Millipore	106406
Sodiumhydroxide	Merck Millipore	106498
Steritop™ filter unit	Merck Millipore	SCGPT05RE
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set	Beckman Coulter	331336
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Tris hydrochloride	AppliChem	A1087
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid	Virapur		Freshly thawed on 4°C