JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

Uyanık Farelerde Nöroaktif Maddelerin Microiontophoretic Uygulaması ile birlikte Nöronal Faaliyet dışı Kaydı

Published: May 21, 2016
doi:
10.3791/53914
, , , ,
1Auditory Neuroscience Laboratory, Institute of Neuroscience of Castilla y León,University of Salamanca, 2Neural Systems Laboratory, Institute for Systems Research,University of Maryland, 3Medical Research Council Institute of Hearing Research, 4Department of Cell Biology and Pathology, Faculty of Medicine,University of Salamanca

Summary

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Abstract

nörotransmitter ve nöromodülatör, ve sonuç olarak, farklı sinir yanıtların aktivitesi farklılıklar, anestezi uygulanmış ve uyanıklık hayvanlar arasında bulunabilir. Bu nedenle, uyanık hayvanlarda sinaptik sistemlerinin manipülasyonu izin yöntemleri anestezik etkilenmeyen nöronal işleme sinaptik girdilerin katkısını belirlemek için gereklidir. Burada, biz aynı anda dışı nöral aktiviteyi kaydetmek ve uyanık farelerde kayıt sitelerin yakınında birden çok nöroaktif maddelerin serbest bırakmak için elektrotların yapımında metodoloji sunuyoruz. Bu prosedürleri birleştirerek, biz seçici kafa ölçülü farelerin alt kollikulusun nöronlarda GABA A reseptörleri bloke etmek gabazine ve microiontophoretic enjeksiyonları yapıldı. Gabazine başarılı şekilde frekans tepki alan ve uyarıcı özgü adaptasyon olarak nöral yanıt özelliklerinin güncellenmiştir. Bu nedenle, biz yöntemleri recordin için uygun olduğunu göstermektedirg tek birim faaliyet ve işitsel işleme belirli nörotransmiter reseptörlerinin rolü diseksiyon için.

anlatılan prosedür ana sınırlama kayıt oturumları için hayvanın alışkanlık düzeyine göre belirlenir nispeten kısa kayıt süresi (~ 3 saat) 'dir. Diğer taraftan, çoklu kayıt seansları aynı hayvanda gerçekleştirilebilir. sinir iletiminin ya da (örneğin, sistemik enjeksiyonlar veya Optogenetic modellerin kullanımı gibi) nöromodülasyon seviyesini değiştirmek için kullanılan çeşitli deney prosedürler üzerinde bu tekniğin avantajı, ilaç etkisi, hedef nöron yerel sinaptik girişlerine sınırlı olmasıdır. Buna ek olarak, elektrot özel imalat nöral yapı ile (örneğin, kayıt sinyal-gürültü oranını geliştirmek için uç direnci gibi) ilgi nöron tipine göre belirli parametrelerin ayarlanmasına olanak tanır.

Introduction

Nöral eksitasyon ve inhibisyon etkileşimi duyusal bilginin 1 işlenmesi için esastır. Ayrıca anestezi kortikal aktivasyonu ve sinaptik girdilerin 2,3 zamansal desen dinamikleri üzerinde güçlü bir etkiye sahip olduğu bilinmektedir. Örneğin, anestetikler kortikal nöronlar 3,4 görsel olarak uyarılmış yanıtların süresini değiştirebilir gözlenmiştir. Ayrıca, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdiler arasındaki oran hem uyarılmış değiştirerek ve spontan aktivite oranları 6,7, anestezi ve uyanık hayvanlarda 4,5 farklıdır. Uyanıklık sırasında, inhibisyon uyarma daha güçlü iken sinaptik iletkenlikleri ölçülerek, Haider ve arkadaşları 4 anestezi altında genlik bu engelleme eşleşen uyarma bulundu. Bu bulgular uyanık hayvanlarda duyusal işleme belirli sinaptik girdilerin etkilerini incelemek için deneysel prosedürlerin geliştirilmesini ister.

<p class = "jove_content"> (nA sırasına) küçük akım enjeksiyonları uygulanarak tahsil nöroaktif maddelerin kontrollü ejeksiyon yoğun sinaptik girdilerin katkısı ve duyusal işleme 8-13 varsayımsal hücre reseptörlerinin rolünü incelemek için kullanılır olmuştur . microiontophoresis olarak bilinen bu teknik, hızlı ve sınırlı etkiye katkıda kaydedilen nöron yakın ilaç uygulama sağlar. Bu prosedür, örneğin, sistemik enjeksiyonlar, mikrodiyaliz ya Optogenetic tekniklerin kullanılması gibi başka deneysel manipülasyonlar tarafından ortaya yaygın etkisi ile karşılaştırıldığında, nöroaktif maddelere lokal etkilerini araştırmak için daha uygundur. Genellikle, bir domuz geri elektrot konfigürasyonu 14,15 eşzamanlı hedef nöron kaydetmek ve ilgi nöroaktif maddelerin teslim etmek için kullanılır. Bu nöroaktif maddeleri taşıyan bir multibarrel pipet bağlı bir kayıt elektrotu içerir. o DeğişikliklerHavey ve CASPARY 14 tarafından açıklanan riginal prosedür uygulanmıştır. Örneğin, bir tungsten elektrot yerine cam, bir nöral etkinlik 16 kaydetmek için kullanılabilir. Kayıt gereksinimlerini karşılamak için tungsten tel ipuçları, cam izolasyon ve uç maruz kalma uyum elektrolitik dağlama: tungsten elektrotlar 17,18 imalatı için daha önce yayınlanmış yöntemler üç genel adımları içerir.

Işitsel nörobilim ilginç ve acil saha uyaran özel adaptasyon (SSA 19) çalışmadır. SSA Diğer nadiren sunulan seslere genelleme değildir tekrarlayan seslere nöral yanıt belirli bir azalmadır. SSA önemi potansiyeli 20,21 uyarılmış işitsel beyin nöral mekanizma yatan sapma tespiti yanı sıra işitsel geç uyumsuzluk olumsuzluk bileşeni için olası bir nöronal karşılığı olarak potansiyel rolü bulunur. SSA oişitsel korteks 19,22-24 kadar IC ccurs. GABA A aracılı inhibisyonunun anestezi 26 etkilenebilir gösterilmiştir SSA 7,16,25 bir kazanç kontrol mekanizması olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Burada daha önce ve uyanık farelerde GABAA reseptörlerinin seçici bir antagonist uygulaması esnasında IC nöronlarının tek ünite aktivite kayıt için daha önce tarif edilen yöntemleri birleştiren bir protokol mevcut. İlk olarak, biz domuz geri elektrotlar ve sonraki, cerrahi ve kayıt yöntemlerinin üretimi açıklar. ilaç salımı etkinliği test etmek için, açık alan hem de önce ve gabazine arasında microiontophoretic ejeksiyon sırasında IC nöronların SSA seviyesini karşılaştırıldı.

Protocol

Tüm deney prosedürleri onayı ile Salamanca Üniversitesi'nde yürütülen edildi ve standartlarına uygun yöntemler kullanılarak, Salamanca Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi yanı sıra Avrupa Birliği standartları (Direktif 2010/63 / EU) için nörolojik araştırma hayvanların kullanımı. 1. Tungsten elektrotlar Not:. Tungsten elektrot üretimi Merrill ve Ainsworth 27 ve Ainsworth ve arkadaşları 28'de tarif edilen özgün tekniğe göre ve Bull…

Representative Results

Biz IC 4 iyi izole nöronların tek ünite aktivitesini kaydedildi. Uyanık farelerde hücre dışı kayıtları elde edilen tipik bir sinyal-gürültü oranı Şekil 3B'de gösterilmiştir. Şekil 4A önce ve GABA A blokajı gabazine ile reseptörlerinin boyunca her nöron frekans tepki alanını (FRA) göstermektedir. tepki kuvveti (ani / uyaran) ve spektral ayarlama bir genişlemesi olarak bir artışı gözlenmiştir. Uyarılmış yan?…

Discussion

Uyanık hayvanlarda nöroaktif maddelerin microiontophoresis soruşturma ve tek nöronların 40,41 aktivitesi belirli sinaptik girdilerin rolünü incelemek için güçlü bir tekniktir. Daha da önemlisi, bu işlem anestezik potansiyel müdahalesi olmadan nöral devrelerinde nörotransmitter ve nöromodülatör etkisi belirlenmesini sağlar. Burada, biz uyanık farelerin IC gabazine uygulaması sağlam frekans ayarlama (Şekil 4A), geçici tepki desenleri (Şekil 4B) ve SSA …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MINECO tarafından finanse edildi Bu proje BFU201343608-P ve PSI2013-49348-EXP ve ARP MSM ve MRC çekirdek fonlarına JCYL hibe SA343U14 verir. YAA bir CONACyT (216106) ve Eylül dostluk düzenledi.

Materials

Tungsten wire Harvard Apparatus LTD 33-0099 0.005 inches x 3 inches
Borosilicate glass capillary  Harvard Apparatus LTD 30-0053 Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long
Multibarrel glass capillaries  World Precision Instruments 5B120F-4  5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament
Diaplus DiaDent 2001-2101 Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette
G-Bond GC Corporation 2277 Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull
Charisma Heraeus Kulzer 66000087 Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull
Araldit Cristal Ceys 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette
Heating blanket Cibertec RTC1
Stereotactic frame Narishige SR-6N Modified for mice
Microiontophoretic device Harvard Apparatus LTD Neurophore BH-2 Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module
Multibarrel glass pipette puller Narishige Model PE-21
LED lamp Technoflux CV-215 5 W, 430-485 nm
MicroFil World Precision Instruments MF34G-5 Flexible plastic needle, 34 AWG
Imalgene Merial Ketamine, 100 mg/mL
Rompun Bayer Xylazine, 20 mg/mL
Gabazine / SR-95531 Sigma S106 Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harris, K. D., Thiele, A. Cortical state and attention. Nat Rev Neurosci. 12 (9), 509-523 (2011).
  2. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
  3. Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J. H., Frohlich, F. Awake vs. anesthetized: layer-specific sensory processing in visual cortex and functional connectivity between cortical areas. J Neurophysiol. 113 (10), 3798-3815 (2015).
  4. Haider, B., Hausser, M., Carandini, M. Inhibition dominates sensory responses in the awake cortex. Nature. 493 (7430), 97-100 (2013).
  5. Rudolph, M., Pospischil, M., Timofeev, I., Destexhe, A. Inhibition determines membrane potential dynamics and controls action potential generation in awake and sleeping cat cortex. J Neurosci. 27 (20), 5280-5290 (2007).
  6. Buran, B. N., von Trapp, G., Sanes, D. H. Behaviorally gated reduction of spontaneous discharge can improve detection thresholds in auditory cortex. J Neurosci. 34 (11), 4076-4081 (2014).
  7. Duque, D., Malmierca, M. S., Caspary, D. M. Modulation of stimulus-specific adaptation by GABA(A) receptor activation or blockade in the medial geniculate body of the anaesthetized rat. J Physiol. 592, 729-743 (2014).
  8. Stone, T. W. . Microiontophoresis and Pressure Ejection. , (1985).
  9. Lalley, P. M., Windhorst, U., Johansson, H. . Modern techniques in neuroscience research). , 193-212 (1999).
  10. Foeller, E., Celikel, T., Feldman, D. E. Inhibitory sharpening of receptive fields contributes to whisker map plasticity in rat somatosensory cortex. J Neurophysiol. 94 (6), 4387-4400 (2005).
  11. Foeller, E., Vater, M., Kossl, M. Laminar analysis of inhibition in the gerbil primary auditory cortex. J Assoc Res Otolaryngol. 2 (3), 279-296 (2001).
  12. Kurt, S., Crook, J. M., Ohl, F. W., Scheich, H., Schulze, H. Differential effects of iontophoretic in vivo application of the GABA(A)-antagonists bicuculline and gabazine in sensory cortex. Hear Res. 212 (1-2), 224-235 (2006).
  13. Sivaramakrishnan, S., et al. GABA(A) synapses shape neuronal responses to sound intensity in the inferior colliculus. J Neurosci. 24 (21), 5031-5043 (2004).
  14. Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing ‘piggy-back’ multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 48 (2), 249-251 (1980).
  15. Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses. J Vis Exp. (71), e4358 (2013).
  16. Perez-Gonzalez, D., Hernandez, O., Covey, E., Malmierca, M. S. GABA(A)-Mediated Inhibition Modulates Stimulus-Specific Adaptation in the Inferior Colliculus. PLoS ONE. 7 (3), e34297 (2012).
  17. Bullock, D. C., Palmer, A. R., Rees, A. Compact and easy-to-use tungsten-in-glass microelectrode manufacturing workstation. Med Biol Eng Comput. 26 (6), 669-672 (1988).
  18. Sugiyama, K., Dong, W. K., Chudler, E. H. A simplified method for manufacturing glass-insulated metal microelectrodes. J Neurosci Methods. 53 (1), 73-80 (1994).
  19. Ulanovsky, N., Las, L., Nelken, I. Processing of low-probability sounds by cortical neurons. Nat Neurosci. 6 (4), 391-398 (2003).
  20. Escera, C., Malmierca, M. S. The auditory novelty system: An attempt to integrate human and animal research. Psychophysiology. 51 (2), 111-123 (2014).
  21. Malmierca, M. S., Sanchez-Vives, M. V., Escera, C., Bendixen, A. Neuronal adaptation, novelty detection and regularity encoding in audition. Front Syst Neurosci. 8, 111 (2014).
  22. Malmierca, M. S., Cristaudo, S., Perez-Gonzalez, D., Covey, E. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the anesthetized rat. J Neurosci. 29 (17), 5483-5493 (2009).
  23. Antunes, F. M., Nelken, I., Covey, E., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the auditory thalamus of the anesthetized rat. PLoS ONE. 5 (11), 14071 (2010).
  24. von der Behrens, W., Bauerle, P., Kossl, M., Gaese, B. H. Correlating stimulus-specific adaptation of cortical neurons and local field potentials in the awake rat. J Neurosci. 29 (44), 13837-13849 (2009).
  25. Perez-Gonzalez, D., Malmierca, M. S. Variability of the time course of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 107 (2012).
  26. Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Struct Funct. , (2014).
  27. Merrill, E. G., Ainsworth, A. Glass-coated platinum-plated tungsten microelectrodes. Med Biol Eng. 10 (5), 662-672 (1972).
  28. Ainsworth, A., Dostrovsky, J. O., Merrill, E. G., Millar, J. An improved method for insulating tungsten micro-electrodes with glass [proceedings]. J Physiol. 269 (1), 4-5 (1977).
  29. Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178 (1), 75-79 (2009).
  30. Portfors, C. V., Roberts, P. D., Jonson, K. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neurosciences. 162 (2), 486-500 (2009).
  31. Portfors, C. V., Mayko, Z. M., Jonson, K., Cha, G. F., Roberts, P. D. Spatial organization of receptive fields in the auditory midbrain of awake mouse. Neurosciences. 193, 429-439 (2011).
  32. Muniak, M. A., Mayko, Z. M., Ryugo, D. K., Portfors, C. V. Preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers. J Vis Exp. (64), (2012).
  33. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
  34. Malmierca, M. S., et al. A discontinuous tonotopic organization in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 28 (18), 4767-4776 (2008).
  35. Izquierdo, M. A., Gutierrez-Conde, P. M., Merchan, M. A., Malmierca, M. S. Non-plastic reorganization of frequency coding in the inferior colliculus of the rat following noise-induced hearing loss. Neurosciences. 154 (1), 355-369 (2008).
  36. Palmer, A. R., Shackleton, T. M., Sumner, C. J., Zobay, O., Rees, A. Classification of frequency response areas in the inferior colliculus reveals continua not discrete classes. J Physiol. 591 (16), 4003-4025 (2013).
  37. Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation and deviance detection in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 89 (2013).
  38. Duque, D., Perez-Gonzalez, D., Ayala, Y. A., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Topographic distribution, frequency, and intensity dependence of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 32 (49), 17762-17774 (2012).
  39. Ayala, Y. A., Perez-Gonzalez, D., Duque, D., Nelken, I., Malmierca, M. S. Frequency discrimination and stimulus deviance in the inferior colliculus and cochlear nucleus. Front Neural Circuits. 6, 119 (2013).
  40. Perkins, M. N., Stone, T. W. In vivo release of [3H]-purines by quinolinic acid and related compounds. Br J Pharmacol. 80 (2), 263-267 (1983).
  41. Lalley, P. M., Windhorst, U., Johansson, H. . Modern Techniques in Neuroscience Research. , 193-212 (1999).
  42. Candy, J. M., Boakes, R. J., Key, B. J., Worton, E. Correlation of the release of amines and antagonists with their effects. Neuropharmacology. 13 (6), 423-430 (1974).
  43. Martins, A. R., Froemke, R. C. Coordinated forms of noradrenergic plasticity in the locus coeruleus and primary auditory cortex. Nat Neurosci. , (2015).
  44. LeBeau, F. E., Rees, A., Malmierca, M. S. Contribution of GABA- and glycine-mediated inhibition to the monaural temporal response properties of neurons in the inferior colliculus. Journal of Neurophysiology. 75 (2), 902-919 (1996).
  45. Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Cholinergic modulation of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. The Journal of Neuroscience. 35 (35), 12261-12272 (2015).

Tags

Extracellular RecordingNeuronal ActivityMicroiontophoretic ApplicationNeuroactive SubstancesAwake MiceSensory SystemsNeurotransmittersNeuronal Modulatory SystemsTungsten WiresEtchingBorosilicate Glass CapillaryBoric Bead

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Ayala, Y. A., Pérez-González, D., Duque, D., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice. J. Vis. Exp. (111), e53914, doi:10.3791/53914 (2016).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image