Laser-assistita Microdissection (LAM) come strumento per trascrizionale Profiling di tipi di cellule individuali
Summary
Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.
Abstract
The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.
Introduction
In studi trascrizionali fatto a livello dei tessuti, i trascrittomi di tipi di cellule altamente specializzate, ma rare sono spesso mascherati da i più abbondanti cellule circostanti. Un esempio di tali tipi di cellule altamente specializzate sono le cellule della linea riproduttivo femminile (germinale) in piante. La linea germinale femminile è specificato all'interno di ovuli in via di sviluppo, i precursori di semi all'interno del gineceo del 1,2 fiore. La cellula madre megaspore (MMC) è la prima cellula della linea germinale femminile. Subisce meiosi per formare una tetrade di macrospora ridotti. Tipicamente, solo uno di questi macrospora sopravvive e divide mitoticamente senza citochinesi, cioè, in un sincizio. Questi mitosi sono seguiti da cellularization per formare il gametofito maturo, che in genere si compone di quattro tipi di cellule: tre antipodals, due celle synergid, l'uovo e la cellula centrale. Le cellule uovo e centrali sono i gameti femminili che vengono fecondati da due spermatozoi durante doufecondazione ble per dare origine a un embrione e endosperma del seme 1,2 sviluppo. Nel sessuale sistema modello Arabidopsis thaliana, solo ~ 50 semi si sviluppano per fiore mentre circa 50 – 80 semi si sviluppano per fiori in genere strettamente correlati Boechera. Così, la linea germinale femminile è costituito da pochi tipi di cellule altamente specializzate, che lo rende un ottimo modello per lo studio dei processi di sviluppo, come ad esempio le specifiche e la differenziazione cellulare.
Inoltre, approfondimenti sui processi di regolazione genica che regolano la riproduzione delle piante possono essere di valore applicata. Nelle piante, può avvenire sia riproduzione sessuata e asessuata attraverso i semi (apomissia). Mentre riproduzione sessuale genera la diversità genetica in una popolazione, Apomixis conduce alla formazione di progenie clonale che è geneticamente identica alla pianta madre. Pertanto, apomissia ha un grande potenziale per le applicazioni in agricoltura e produzione di sementi, come anche complesse genotipi materni puòessere mantenuta inalterata per diverse generazioni 3,4,5. Perché apomissia non si trova naturalmente in tutte le principali specie coltivate, la progettazione di apomissia nelle colture è di grande interesse 3,4,5. Tuttavia, questo obiettivo a lungo termine è difficile da raggiungere perché la base genetica e molecolare alla base di apomissia non viene compreso in modo sufficientemente dettagliato 6.
Per acquisire conoscenze in base trascrizionale che regolano la riproduzione apomittica, specifici per tipo di cellula trascrizionale profilatura mediante microdissezione laser assistita (LAM) e sequenziamento di nuova generazione (NGS) rappresenta un approccio molto potente 7,8. LAM è stata in primo luogo stabilito per l'animale e la ricerca biomedica. Negli ultimi anni LAM è stata anche applicata alla biologia vegetale 6,9,10. A differenza di altri metodi che consentano profilatura dei singoli tipi di cellule e tessuti, LAM non richiede la generazione di linee marcatore 6,9,10. Pertanto, può essere appmentito a qualsiasi tipo di cellula o tessuto senza conoscenza molecolare preventiva. Un altro vantaggio di LAM è che può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula finché la cella può essere riconosciuta in sezioni asciutte base alla posizione e / o caratteristiche strutturali. LAM ha il vantaggio aggiuntivo che vengono utilizzati tessuti fissati, che impedisce variazioni del profilo trascrizionale durante la lavorazione.
Il tessuto di interesse, ad esempio, il tessuto floreale, è fissato in un fissativo non reticolazione prima inclusione in paraffina. Incorporare in cera di paraffina può essere effettuata manualmente, seguendo i protocolli stabiliti 9,11. Tuttavia, l'impiego di un processore tessuti automatizzato per la disidratazione e l'infiltrazione con la cera genera risultati riproducibilità in termini di conservazione della qualità dell'RNA e morfologia tissutale. La strategia alternativa di incorporare tessuti in resina è stato anche utilizzato con successo per le analisi specifiche per tipo di cellula da LAM 8. Tuttavia, l'uso di un automprocessatore ated per l'incorporamento in cera è molto tempo efficiente, come molti campioni possono essere trattati contemporaneamente richiedono un minimo di mani-in tempo. Mentre tipicamente alcuna perdita significativa di qualità dell'RNA avviene durante la fissazione e inclusione, la preparazione di sezioni sottili con il microtomo e, in particolare, il montaggio sulle frameslides utilizzati per LAM rimane un punto critico per la conservazione della qualità dell'RNA. Ciò è stato notato in precedenza e l'uso di un sistema di trasferimento nastro è stato descritto per una migliore qualità dell'RNA in questa fase 12. Tuttavia, questo aggiunge un passo tempo supplementare durante la preparazione dei vetrini e richiede anche attrezzature speciali. Il protocollo ottimizzato descritto di seguito produce riproducibile RNA che è di qualità sufficiente per profilatura trascrizionale con GeneChip e Next Generation Sequencing (NGS) si avvicina 7,11,13,14. Inoltre, con il microscopio microdissezione laser utilizzato, un'elevata purezza dei tipi di cellule isolate è rottainely prodotto 7,11,13,14.
Il genere Boechera è un sistema modello eccellente per studiare i passaggi chiave della riproduzione apomittica. In Boechera, una varietà di diverse adesioni sessuali e apomittici sono stati identificati e può essere utilizzato per analisi comparative 15,16,17. In un confronto di trascrittomi cellule specifiche per il tipo di cellule della linea germinale femminile da Arabidopsis sessuale e apomittica Boechera, abbiamo identificato geni e vie che sono espressi in modo differenziale, individuando così nuovi aspetti dei processi regolamentari che disciplinano Apomixis 7. Inoltre, questo studio ha verificato l'idoneità di LAM per specifico tipo cellulare trascrizionale analisi di tipi di cellule piccole e rare. Abbiamo già usato questo protocollo per l'analisi dei diversi tipi di cellule in una varietà di specie vegetali, ma specie-e modifiche tessuto-specifici al protocollo può essere richiesto in alcuni casi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo è adatto a diversi tipi di tessuto cellulare e
LAM combinato con trascrittoma analisi per microarrays o RNA-Seq è un valido strumento per acquisire conoscenze in modelli specifici di attività dei geni che regolano i processi di sviluppo o fisiologici 7-11,13,14. Tuttavia, l'idoneità di questo metodo per un dato tipo di cellula dipende criticamente sui problemi strutturali. La cella deve essere chiaramente visibili e senza ambiguità identific…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG´s laboratory is supported by the University of Zürich, by a fellowship of the “Deutsche Forschungsgemeinschaft” and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the “Staatssekretariat für Bildung und Forschung” in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).
Materials
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1,4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devises are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
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