Eine Methode zum Ziel und Isolieren Airway-innervating sensorischen Neuronen bei Mäusen
Summary
Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Abstract
Somatosensory Nerven transduzieren thermische, mechanische, chemische und schädliche sowohl von endogenen und Umwelteinflüsse verursacht Reize. Die Zellkörper dieser afferenten Neuronen innerhalb der sensorischen Ganglien. Sensorischen Ganglien ein spezifisches Organ oder Teil des Körpers innervieren. Zum Beispiel werden die Spinalganglien (DRG) in der Wirbelsäule angeordnet und erstrecken sich Prozesse im gesamten Körper und Gliedmaßen. Die Trigeminalganglien sind im Schädel und innervate das Gesicht befindet, und der oberen Atemwege. Vagal Afferenzen der nodose Ganglien erstrecken sich in den Darm, Herz und Lunge. Die nodose Neuronen steuern, um eine Vielfalt von Funktionen wie: Atemfrequenz, Reizung der Atemwege und Husten Reflexe. Somit, um ihre Funktion zu verstehen und zu manipulieren, ist es entscheidend Atemweg spezifischen neuronalen Subpopulationen zu identifizieren und zu isolieren. Bei der Maus werden die Atemwege zur retrograden Tracing von Atemwegsspezifischen nodose Neuron zu einem fluoreszierenden Tracer-Farbstoff, Fast Blue, ausgesetzts. Die nodose Ganglien dissoziiert und Fluorescence Activated Cell (FAC) Sortierung verwendet wird Farbstoff-positiven Zellen zu sammeln. Als nächstes wird aus positiven Zellen Farbstoff für die Sequenzierung der nächsten Generation extrahiert hoher Qualität Ribonukleinsäure (RNA). Mit dieser Methode Atemwegs spezifische neuronale Genexpression bestimmt wird.
Introduction
Somatosensory Nerven transduzieren thermische, mechanische, chemische und schädliche sowohl von endogenen und Umwelteinflüsse verursacht Reize. Die Zellkörper dieser afferenten Nerven in sensorischen Ganglien, wie die Spinalgan, trigeminal oder nodose ganglia befindet. Jedes sensorische ganglion innervates spezifischen Regionen des Körpers und enthält Zellen, die getrennte Organe und Gewebe innerhalb dieser Region innervieren. So werden zum Beispiel die Dorsalwurzelganglien (DRG) in der Wirbelsäule angeordnet und erstrecken sich Prozesse im ganzen Körper und Gliedmaßen, während die Trigeminalganglien im Schädel befinden, enthält Neuronen, die das Gesicht, Augen, Hirnhaut oder der oberen Atemwege 1 innervate, 2. Die nodose Ganglien des Nervus vagus im Hals unterhalb des Schädels und enthält Zellkörper , die Nervenfasern im gesamten Magen – Darm – Trakt, Herz erstrecken und unteren Atemwege und Lungen 3. Beim Menschen steht das Ganglion nodosum allein, jedoch in der Maus, um es fusioniert istmit dem Ganglion jugulare, die auch die Lunge 4 innervates. Das fusionierte Ganglion wird oft die Gurgel / nodose Komplex, Vagus – Ganglion oder einfach Ganglion nodosum 5 genannt. Hier wird bezeichnet als das Ganglion nodosum.
Afferenzen der nodose passieren Informationen von den Eingeweiden zum Kern des einsamen-Darm-Trakt (NTS) im Hirnstamm. Sensorischen Input zu diesem einzigartigen Ganglion steuert eine Vielfalt von Funktionen, wie Darmmotilität 6, Herzfrequenz 7, Atmung 8,9 und Reizaktivierte Atmungsreaktionen 10,11. Bei dieser Vielfalt der Funktionen und innervated Organe ist es entscheidend, organspezifische Subpopulationen des Ganglion nodosum, um einzelne zu studieren neuronalen Bahnen zu zielen und zu isolieren. Es können jedoch die geringe Größe des nodose und die begrenzte Anzahl von Neuronen gegebenen enthält dieses keine triviale Aufgabe. Jede Maus Ganglion nodosum enthält ungefähr 5.000 Neuronen 12zusätzlich zu einer umfangreichen Bevölkerung von Satellitenzellen zu unterstützen. Von den 5.000 nodose Neuronen, nur 3 bis 5% innervate die Atemwege. Daher werden alle funktionalen, morphologische oder molekulare Veränderungen im Atemweg-innervating Neuronen, durch Atemstimulation oder Pathologien, in der dicht gepackten Ganglion nodosum verloren.
Um dieses Problem zu lösen, wurde ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung Neuronen entwickelt, die die Atemwege innervate. Die Atemwege wurden mit einem fluoreszierenden Markierungsfarbstoff ausgesetzt, um die nachfolgenden innervating nodose Neuronen zu identifizieren. Fast Blue wurde von Neuronen und wandert schnell in ihre Zellkörper aufgenommen , wo es für bis zu acht Wochen 13 zurückgehalten wird – 15. Einmal identifiziert, eine sanfte, aber wirksame, Dissoziation Protokoll verwendet wurde, Farbstoffmarkierung und die Lebensfähigkeit von Zellen fluoreszenzaktivierte Zell (FAC) Sortierung zu erhalten. Sortierte Zellen werden verwendet, um hohe Qualität Ribonukleinsäure (RNA) extrahieren Genexpression oder f, um zu bestimmenoder andere Downstream-Genanalyse. Dieses Protokoll stellt eine nützliche und robuste Technik zur Isolierung von sensorischen Neuronen, die ein Gewebe von Interesse innervate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren Atemwegs-innervating Neuronen in der nodose Ganglien des Nervus vagus zu zielen. Einmal markiert, werden die Ganglien sanft distanzierte optimal Zellzahlen und die Lebensfähigkeit zu erhalten. Diese Neuronen sind dann FAC sortiert direkt in Lysepuffer und RNA extrahiert wird. Die Bedeutung dieses Protokolls ist die Fähigkeit, zu zielen, zu isolieren, und die Qualität einer bestimmten Sinneszellpopulation zu erhalten. Genexpression wird in diesem kleinen Population von Neurone…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt von NIH gewähren R01HL105635 zu SEJ. Die Autoren möchten sich Diego V. Bohórquez für technische Beratung danken. Wir danken auch R. Ian Cumming für die technische Unterstützung und die Durchflusszytometrie im Duke Humanimpfstoff Institut Forschung Durchflusszytometrie Shared Resource Facility-Durchführung (Durham, NC). Die Durchflusszytometrie wurde im Regional Biocontainment Laboratory an der Duke durchgeführt, die teilweise Unterstützung für den Bau von den National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (UC6-AI058607) erhalten.
Materials
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
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