שיטה לכוון ולבודד Airway-innervating עצב סנסורי של עכברים
Summary
Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Abstract
עצבים חושיים transduce תרמית, מכאני, כימי, גירוי מזיק נגרם על ידי שני סוכני אנדוגני וסביבתיים. גופי התא של הנוירונים מביאים אלה ממוקמים בתוך הגרעינים החושיים. גרעינים חושיים מעצבבי איבר או חלק מסוים של הגוף. למשל, הגרעינים השורש הגבי (DRG) ממוקמים עמוד השדרה ולהרחיב תהליכים בכל הגוף והגפיים. גרעיני trigeminal ממוקמים הגולגולת המעצבבים את הפנים, ואת דרכי נשימה עליונות. afferents מחנק של הגרעינים nodose להאריך ברחבי הבטן, הלב והריאות. הנוירונים nodose לשלוט מערך מגוון של פונקציות כגון: קצב הנשימה, גירוי בדרכי הנשימה, שיעול ורפלקסים. לכן, כדי להבין ולטפל תפקידם, חשוב לזהות ולבודד תת-אוכלוסיות עצביות ספציפיות דרך נשימה. בשנת העכבר, את דרכי הנשימה נחשפות לצבוע נותבו ניאון, מהיר כחולה, לאיתור מדרדר של נוירון nodose ספציפי דרך נשימהים. גרעיני nodose הם ניתקו ותא מופעל קרינה (FAC) מיון משמש לאיסוף תאי צבע חיוביים. לאחר מכן, חומצה ריבונוקלאית באיכות גבוהה (RNA) מופקת תאים חיוביים לצבוע עבור סידור הדור הבא. באמצעות דרכי הנשימה בשיטה זו ביטוי גנים עצבי ספציפי נקבע.
Introduction
עצבים חושיים transduce תרמית, מכאני, כימי, גירוי מזיק נגרם על ידי שני סוכני אנדוגני וסביבתיים. גופי התא של עצבים מביאים אלה ממוקמים בגרעיני חושי, כגון שורש הגבה, trigeminal, או גרעיני nodose. כל גנגליון חושי מעצבב אזורים ספציפיים בגוף ומכיל תאי מעצבבי איברים ורקמות נפרדים בתוך אזור זה. למשל, הגרעינים השורש הגבי (DRG) ממוקמים עמוד השדרה ולהרחיב תהליכים בכל הגוף והגפיים, בעוד הגרעינים trigeminal ממוקמים בגולגולת, המכיל נוירונים המעצבבים את הפנים, העיניים, קרומי המוח או העליון דרכי הנשימה 1, 2. גרעיני nodose של העצב התועה ממוקמים בצוואר מתחת הגולגולת מכילים גופי תא שמרחיבים סיבים עצב לאורך כל מערכת העיכול, הלב ודרכי נשימה תחתונה וריאות 3. אצל בני האדם גנגליון nodose עומד בפני עצמו, עם זאת, העכבר הוא התמזגעם גנגליון הצוואר, אשר גם מעצבב ריאות 4. גנגליון התמזג זה נקרא לעתים קרובות צוואר / nodose מורכב, גנגליון המחנק, או פשוט גנגליון 5 nodose. הנה, זה נקרא גנגליון nodose.
סיבים מביאים של nodose להעביר מידע מן הקרביים לגרעין של הדרך הבודדה (NTS) בגזע המוח. קלט חושי אל גנגליון ייחודי זה שולט מערך מגוון של פונקציות, כגון מעי תנועתיות 6, קצב לב 7, נשימת 8,9, ותגובות נשימה מופעלות מגרות 10,11. עם המגוון הזה של פונקציות ואיברים מעוצבבים, חשוב למקד ולבודד subpopulations איבר ספציפי של גנגליון nodose כדי ללמוד מסלולים עצביים הפרט. עם זאת, בהתחשב בגודל הקטן של nodose ואת המספר המוגבל של נוירונים הוא מכיל זו אינה משימה טריוויאלית. כל עכבר nodose גנגליון מכיל בערך 5,000 נוירונים 12בנוסף אוכלוסייה נרחבת של תאים תומכים בלוויין. של 5,000 הנוירונים nodose, רק 3 – 5% innervate את דרכי הנשימה. לכן, כל שינוי פונקציונלי, מורפולוגיים או מולקולרי בתוך הנוירונים דרכי הנשימה-innervating, עקב גירוי בדרך נשימה או פתולוגיות, יאבד גנגליון nodose הצפוף.
כדי לפתור בעיה זו, פותחה שיטה לזהות ולבודד נוירונים המעצבבים את דרכי הנשימה. דרכי האוויר נחשפו לצבוע נותב ניאון כדי לזהות את הנוירונים nodose innervating שלאחר מכן. כחול מהיר נאסף על ידי נוירונים ונוסע במהירות גופי התא שלהם איפה זה נשמר עד שמונה שבועות 13 – 15. לאחר הזיהוי, פרוטוקול עדין, אך יעיל, דיסוציאציה שימש לשמר תיוג לצבוע כדאיות התא עבור התא מופעל ניאון (FAC) מיון. תאים ממוינים משמשים כדי לחלץ חומצה ריבונוקלאית באיכות גבוהה (RNA) כדי לקבוע ביטוי גנים או fאו ניתוח מולקולרי במורד אחר. פרוטוקול זה מספק טכניקה יעילה וחזקה לבודד עצב סנסורי מעצבבי רקמה של עניין.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה למקד נוירונים דרכי הנשימה-innervating בגרעיני nodose של העצב התועה. לאחר שכותרתו, הגרעינים הם ניתקו בעדינות לשמר מספרים סלולריים באופן המיטבי את כדאיות. נוירונים אלה הם אז FAC מסודר ישירות למאגר תמוגה ו- RNA מופק. המשמעות של פרוטוקול זה היא היכולת למקד, לבוד…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמך על ידי NIH מענק R01HL105635 כדי Sej. המחברים מבקשים להודות דייגו V. Bohórquez עבור ייעוץ טכני. אנו מודים גם ר 'איאן קאמינג לקבלת סיוע טכני וביצוע cytometry הזרימה במתקן המשאב המשותף cytometry זרימת מכון מחקר אדם חיסון Duke (Durham, NC). Cytometry זרימה בוצעה במעבדת Biocontainment האזורית באוניברסיטת דיוק שקיבלה תמיכה חלקית לבנייה מן המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (UC6-AI058607).
Materials
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neurosciences. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neurosciences. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol – Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -. Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
