एक विधि को लक्षित और चूहे में अलग-श्वासनली innervating संवेदी न्यूरॉन्स के लिए
Summary
Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Abstract
Somatosensory नसों थर्मल, यांत्रिक, रासायनिक, और दोनों अंतर्जात और पर्यावरण एजेंटों की वजह से हानिकारक उत्तेजनाओं transduce। इन अभिवाही न्यूरॉन्स की सेल निकायों संवेदी गैन्ग्लिया के भीतर स्थित हैं। संवेदी गैन्ग्लिया एक विशिष्ट अंग या शरीर के हिस्से को अंदर आना। उदाहरण के लिए, पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) कशेरुका स्तंभ में स्थित है और शरीर और अंगों भर प्रक्रियाओं का विस्तार कर रहे हैं। त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया ऊपरी वायुमार्ग खोपड़ी में स्थित है और चेहरे अंदर आना रहे हैं, और। ग्रंथिल गैन्ग्लिया के vagal afferents भर पेट, हृदय और फेफड़ों का विस्तार। श्वसन दर, एयरवे जलन, खांसी और सजगता: ग्रंथिल न्यूरॉन्स जैसे कार्यों की एक विविध सरणी नियंत्रित करते हैं। इस प्रकार, समझने और उनके समारोह में हेरफेर करने के लिए है, यह पहचान करने और एयरवे विशिष्ट neuronal उप आबादी को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है। माउस में, वायुमार्ग एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर डाई, फास्ट ब्लू, एयरवे विशेष ग्रंथिल न्यूरॉन के प्रतिगामी ट्रेसिंग के लिए सामने आ रहे हैंएस। ग्रंथिल गैन्ग्लिया अलग कर रहे हैं और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल (एफएसी) छँटाई डाई सकारात्मक कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अगले, उच्च गुणवत्ता ribonucleic एसिड (आरएनए) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए डाई सकारात्मक कोशिकाओं से निकाला जाता है। इस विधि एयरवे विशिष्ट neuronal जीन अभिव्यक्ति निर्धारित किया जाता है का उपयोग करना।
Introduction
Somatosensory नसों थर्मल, यांत्रिक, रासायनिक, और दोनों अंतर्जात और पर्यावरण एजेंटों की वजह से हानिकारक उत्तेजनाओं transduce। इन अभिवाही नसों की सेल निकायों ऐसे पृष्ठीय रूट, त्रिपृष्ठी, या ग्रंथिल गैन्ग्लिया के रूप में, संवेदी गैन्ग्लिया में स्थित हैं। प्रत्येक संवेदी नाड़ीग्रन्थि शरीर के विशिष्ट क्षेत्रों innervates और कोशिकाओं है कि उस क्षेत्र के भीतर अलग अंगों और ऊतकों अंदर आना होता है। उदाहरण के लिए, पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) कशेरुका स्तंभ में स्थित है और शरीर और अंगों भर प्रक्रियाओं का विस्तार, जबकि त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया खोपड़ी में स्थित हैं, न्यूरॉन्स कि चेहरे, आंखों, तानिका या ऊपरी एयरवेज 1 अंदर आना युक्त हैं, 2। वेगस तंत्रिका की ग्रंथिल गैन्ग्लिया खोपड़ी के नीचे गर्दन में कम एयरवेज और फेफड़ों 3 स्थित है और सेल निकायों कि जठरांत्र संबंधी मार्ग, दिल भर तंत्रिका तंतुओं का विस्तार शामिल है, और। मनुष्यों में ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि अकेला खड़ा है, तथापि, माउस में यह जुड़े हुए हैकंठ नाड़ीग्रन्थि है, जो भी फेफड़ों 4 innervates के साथ। यह आपस में जुड़े नाड़ीग्रन्थि अक्सर कंठ / ग्रंथिल जटिल, vagal नाड़ीग्रन्थि कहा जाता है, या बस ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि 5। यहाँ, यह ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि के रूप में जाना जाता है।
ग्रंथिल की अभिवाही फाइबर brainstem में एकान्त पथ (एनटीएस) के नाभिक को आंत से जानकारी गुजरती हैं। इस अनूठी नाड़ीग्रन्थि संवेदी इनपुट ऐसे आंत गतिशीलता 6, हृदय की दर 7, श्वसन 8,9, और अड़चन सक्रिय सांस की प्रतिक्रियाएं 10,11 के रूप में काम करता है, की एक विविध सरणी नियंत्रित करता है। कार्यों और इन्नेर्वतेद अंगों की इस विविधता के साथ, यह लक्ष्य और व्यक्तिगत न्यूरोनल रास्ते का अध्ययन करने के क्रम में ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि के अंग विशेष उप-जनसंख्या को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, ग्रंथिल के छोटे आकार और न्यूरॉन्स की सीमित संख्या के बाद उसमें यह एक तुच्छ काम नहीं है को देखते हुए। नाड़ीग्रन्थि ग्रंथिल प्रत्येक माउस लगभग 5000 न्यूरॉन्स 12 में शामिलउपग्रह कोशिकाओं का समर्थन करने का एक व्यापक आबादी के अलावा। 5% अंदर आना एयरवेज – 5000 ग्रंथिल न्यूरॉन्स, केवल 3 की। इसलिए, एयरवे-innervating न्यूरॉन्स के भीतर किसी भी, कार्यात्मक रूपात्मक या आणविक परिवर्तन, सांस की उत्तेजना या विकृतियों के कारण, घनी पैक ग्रंथिल नाड़ीग्रन्थि में खो जाएगा।
इस समस्या को हल करने के लिए, एक विधि की पहचान करने और न्यूरॉन्स कि वायुमार्ग अंदर आना अलग करने के लिए विकसित किया गया था। वायुमार्ग एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर डाई से अवगत कराया गया बाद में innervating ग्रंथिल न्यूरॉन्स की पहचान। फास्ट ब्लू न्यूरॉन्स द्वारा उठाया और उनके सेल निकायों जहां यह अप करने के लिए आठ सप्ताह 13 के लिए बनाए रखा है के लिए जल्दी से यात्रा कर रहा था – 15। एक बार की पहचान, एक सज्जन, अभी तक कुशल, हदबंदी प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल (एफएसी) छंटाई के लिए डाई लेबलिंग और सेल व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हल कोशिकाओं जीन अभिव्यक्ति या एफ निर्धारित करने के लिए उच्च गुणवत्ता ribonucleic एसिड (आरएनए) निकालने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंया अन्य बहाव आणविक विश्लेषण। इस प्रोटोकॉल संवेदी न्यूरॉन्स कि ब्याज की एक ऊतक अंदर आना अलग-थलग करने के लिए एक उपयोगी और मजबूत तकनीक प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल वेगस तंत्रिका की ग्रंथिल गैन्ग्लिया में एयरवे-innervating न्यूरॉन्स को लक्षित करने के लिए एक विधि का वर्णन है। एक बार लेबल, गैन्ग्लिया धीरे बेहतर सेल नंबर और व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए अलग…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनआईएच द्वारा समर्थित Sej को R01HL105635 अनुदान। लेखकों तकनीकी सलाह के लिए डिएगो वी BOHORQUEZ को धन्यवाद देना चाहूंगा। हम यह भी तकनीकी सहायता के लिए आर कमिंग इयान धन्यवाद और ड्यूक मानव वैक्सीन अनुसंधान संस्थान से फ्लो साझा संसाधन सुविधा (डरहम, नेकां) में प्रवाह cytometry प्रदर्शन। फ्लो का ड्यूक में क्षेत्रीय Biocontainment प्रयोगशाला जो राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और संक्रामक रोग (UC6-AI058607) से निर्माण के लिए आंशिक समर्थन प्राप्त करने में प्रदर्शन किया गया था।
Materials
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
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