方法は、標的とマウスにおけるアイソ気道-神経支配感覚ニューロンへ
Summary
Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Abstract
体性感覚神経は、熱的、機械的、化学的、および内因性と環境因子によって引き起こされる有害な刺激を伝達します。これらの求心性ニューロンの細胞体は、感覚神経節内に配置されています。感覚神経節は、身体の特定の器官または一部を支配します。例えば、後根神経節（DRG）は、脊柱に配置され、身体や手足全体のプロセスを拡張します。三叉神経節は、頭蓋骨に位置し、顔を支配し、上気道されています。節状神経節の迷走神経求心性神経は、腸、心臓、肺全体に延びています。呼吸数、気道の炎症、および咳反射：結節ニューロンは、以下のような機能の多様な配列を制御します。したがって、それらの機能を理解し、操作するために、気道特定のニューロンのサブ集団を同定し、単離することが重要です。マウスでは、気道は、気道固有の結節ニューロンの逆行性トレーシングのために、蛍光トレーサー染料、ファーストブルーにさらされています秒。結節神経節を解離し、蛍光活性化細胞（FAC）選別染料陽性細胞を収集するために使用されます。次に、高品質のリボ核酸（RNA）は、次世代配列決定のための色素陽性の細胞から抽出されます。この方法は、気道の特定の神経細胞の遺伝子発現を使用して決定されます。
Introduction
体性感覚神経は、熱的、機械的、化学的、および内因性と環境因子によって引き起こされる有害な刺激を伝達します。これらの求心性神経の細胞体は、後根、三叉神経、または結節神経節のように、知覚神経節に位置しています。それぞれの感覚神経節は、身体の特定の領域を神経支配し、その領域内の別々の臓器や組織を神経支配する細胞が含まれています。三叉神経節は、顔、目、髄膜または上気道1を神経支配するニューロンを含む、頭蓋骨内に配置されている間、例えば、後根神経節（DRG）は、脊柱に配置され、身体や手足全体のプロセスを拡張します2。迷走神経の節状神経節は、頭蓋骨下の首に位置し、消化管、心臓、および下気道や肺3を通して神経繊維を拡張する細胞体が含まれます。ヒトでは節状神経節は、しかし、マウスでそれが融合されて、一人で立っていますまた、肺4を神経支配頚神経節、と。この融合した神経節は、しばしば頸静/結節複雑、迷走神経節、あるいは単に節状神経節5と呼ばれています。ここでは、結節性神経節と呼ばれています。
結節の求心性線維は、脳幹内の孤束核（NTS）の核に内臓からの情報を渡します。このユニークな神経節への感覚入力は、このような腸運動性6、心拍数7、呼吸8,9、および刺激性活性化呼吸応答10,11として機能し、多様な配列を制御します。機能や神経支配器官のこのような多様性と、個々のニューロン経路を研究するために、節状神経節の臓器特異的亜集団を標的とし、単離することが重要です。しかし、結節のサイズが小さく、それが、これは簡単な作業ではありません含まれているニューロンの数が限られて与えられました。神経節結節各マウスは、およそ5,000のニューロン12が含まれています衛星細胞を支持する大規模な集団に加えました。 5000結節ニューロンの、唯一の三から五までパーセントの神経支配気道。そのため、呼吸器刺激や病理に対する気道-神経支配ニューロン内の任意の機能、形態学的または分子変化は、高密度に充填された節状神経節に失われます。
この問題を解決するために、この方法は、気道を神経支配するニューロンを同定および単離するために開発されました。気道は、その後の神経支配の結節ニューロンを同定するために蛍光トレーサー色素に曝露しました。ファーストブルーは、ニューロンによってピックアップし、それが最大8週間13のために保持され、それらの細胞体に素早く移動した– 15。一度同定、まだ効率的な、穏やかな分離プロトコルは、蛍光活性化細胞（FAC）ソートする色素標識および細胞生存率を維持するために使用しました。選別された細胞は、遺伝子発現またはfを決定するために、高品質のリボ核酸（RNA）を抽出するために使用されまたは他の下流の分子解析。このプロトコルは、関心のある組織を神経支配する感覚ニューロンを単離するのに有用で堅牢な技術を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、迷走神経の節状神経節で気道神経支配ニューロンをターゲットにする方法を説明しています。一旦標識神経節を穏やかに最適細胞数および生存率を維持するために分離されています。これらのニューロンは、その後、FACは、溶解緩衝液に直接ソートされ、RNAが抽出されます。このプロトコルの重要性は、標的に切り分け、および特定の感覚細胞集団の品質を維持する能力?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SEJにNIH助成R01HL105635でサポートされています。著者は、技術的な助言のためにディエゴ・V.Bohórquezに感謝したいと思います。我々はまた、技術支援、デュークヒトワクチン研究所研究フローサイトメトリー共有リソース機能（ダーラム、ノースカロライナ州）でのフローサイトメトリーを実行するためのR.イアンカミングに感謝します。フローサイトメトリー国立衛生研究所、アレルギーの国立研究所感染症（UC6-AI058607）から建設のための部分的なサポートを受けデューク大学の地域の生物学的封じ込め実験室で行いました。
Materials
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
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