En metod att rikta och Isolera Airway-innerverar sensoriska neuroner hos möss
Summary
Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Abstract
Somatosensoriska nerver omvandla termisk, mekanisk, kemisk och skadliga stimuli som orsakas av både endogena och miljöfarliga ämnen. Cellkropparna hos dessa afferenta neuroner är belägna inom sensoriska ganglierna. Sensoriska ganglierna innerverar ett specifikt organ eller en del av kroppen. Till exempel är dorsalrotsganglier (DRG) ligger i ryggraden och sträcker processer i hela kroppen och benen. Trigeminal ganglia är belägna i skallen och innerverar ansiktet, och övre luftvägarna. Vagala afferenter av KNUTIG ganglier sträcker sig genom tarmen, hjärta och lungor. De KNUTIG nervceller styr en mångfald av funktioner såsom: andningsfrekvens, luftvägsirritation och hosta reflexer. Således, för att förstå och manipulera sin funktion, är det viktigt att identifiera och isolera luftvägarna specifika neuronala subpopulationer. I musen, är luftvägarna utsätts för ett fluorescerande spårämne färg, Fast Blue, för retrograd spårning av luftvägsspecifika KNUTIG neurons. De KNUTIG ganglierna är dissocierade och fluorescensaktiverad cell (FAC) sortering används för att samla färgämnes positiva celler. Därefter hög kvalitet ribonukleinsyra (RNA) extraherat från färgämnes positiva celler för nästa generations sekvensering. Med denna metod luftväg specifika neuronala genuttryck bestäms.
Introduction
Somatosensoriska nerver omvandla termisk, mekanisk, kemisk och skadliga stimuli som orsakas av både endogena och miljöfarliga ämnen. Cellkropparna hos dessa afferenta nerver är belägna i sensoriska ganglier, såsom den dorsala rot, trigeminala, eller KNUTIG ganglierna. Varje sensorisk ganglion innerverar specifika regioner av kroppen och innehåller celler som innerverar separata organ och vävnader inom den regionen. Till exempel är dorsalrotsganglier (DRG) ligger i ryggraden och sträcker processer i hela kroppen och armar och ben, medan den trigeminala ganglia ligger i skallen, som innehåller neuroner som innerverar ansikte, ögon, hjärnhinnorna eller övre luftvägarna 1, 2. Den KNUTIG ganglierna av vagusnerven ligger i halsen under skallen och innehåller cellkroppar som sträcker nervfibrerna i hela mag-tarmkanalen, hjärta och nedre luftvägarna och lungorna 3. Hos människa den KNUTIG ganglion står ensam, men i mus det är smältmed halsganglion, som också innerverar lungorna 4. Detta smält ganglion kallas ofta hals / KNUTIG komplex, vagal ganglion, eller helt enkelt KNUTIG ganglion 5. Här är det kallad KNUTIG ganglion.
Afferenta fibrerna i KNUTIG överföra information från inälvor till kärnan av den solitära vägarna (NTS) i hjärnstammen. Sinnesintryck till denna unika ganglion styr en mångfald av funktioner, såsom tarmmotilitet 6, hjärtfrekvens 7, andning 8,9, och irriterande aktiverad andningssvar 10,11. Med denna mångfald av funktioner och innerverade organ, är det viktigt att rikta och isolera organspecifika subpopulationer av KNUTIG ganglion för att studera enskilda nervbanorna. Men med tanke på den begränsade storleken på den KNUTIG och det begränsade antalet neuroner den innehåller detta inte är en trivial uppgift. Varje mus KNUTIG ganglion innehåller ungefär 5000 neuroner 12förutom en omfattande population av stödjande satellitceller. Av de 5.000 KNUTIG nervceller, bara 3-5% innerverar luftvägarna. Därför några funktionella, morfologiska eller molekylära förändringar inom luftvägarna-innerverar neuroner, på grund av andningsstimulering eller sjukdomar, kommer att förloras i den tätt packade KNUTIG ganglion.
För att lösa detta problem, utvecklades en metod för att identifiera och isolera neuroner som innerverar luftvägarna. Luftvägarna exponerades för ett fluorescerande spårämne färg för att identifiera de efterföljande innerverar KNUTIG neuroner. Fast Blue plockades upp av nervceller och färdas snabbt till sina cellkroppar där den behålls för upp till åtta veckor 13 – 15. När detta har skett, en mild men ändå effektiv, dissociation protokoll användes för att bevara färgmärkning och cellviabilitet för fluorescensaktiverad cell (FAC) sortering. Sorterade celler är avsedda att suga högkvalitativ ribonukleinsyra (RNA) för att bestämma genexpression eller feller annan nedströms molekylär analys. Detta protokoll ger en användbar och robust teknik för att isolera sensoriska neuroner som innerverar en vävnad av intresse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för att rikta luftvägarna-innerverar nervceller i KNUTIG ganglierna av vagusnerven. När märkt, är ganglierna försiktigt dissocierade att optimalt bevara cellantal och livskraft. Dessa nervceller är då FAC sorteras direkt i lysbuffert och RNA extraheras. Betydelsen av detta protokoll är förmågan att rikta, isolera och bevara kvaliteten på en specifik sensorisk cellpopulation. Genuttryck beskrivs i denna lilla population av nervceller, och organspecifika funktioner och neural…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Med stöd av NIH bevilja R01HL105635 till SEJ. Författarna vill tacka Diego V. Bohórquez för teknisk rådgivning. Vi tackar också R. Ian Cumming för tekniskt stöd och utföra flödescytometri vid Duke Human Vaccine Institute Research flödescytometri Delad Resource Facility (Durham, NC). Flödescytometri utfördes i regionala biologisk inneslutning Laboratory vid Duke som fick delvis stöd för byggande av National Institutes of Health, National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (UC6-AI058607).
Materials
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neurosciences. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neurosciences. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol – Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -. Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
