Bir Yöntem Hedef ve Fare İzole Havayolu-innerve Duyu Nöronlar için
Summary
Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Abstract
Somatosensoriyel sinirler termal, mekanik, kimyasal, hem endojen ve çevresel faktörlerden oluşan zararlı uyaranlara transduce. Bu afferent nöronların hücre gövdeleri duyusal ganglionlar içinde yer almaktadır. Duyu ganglion vücudun belirli bir organ veya bir kısmını innerve. Örneğin, dorsal kök gangliyon (DRG) Vertebral kolon bulunan ve vücutta ve bacaklarda boyunca süreçleri uzatmak. trigeminal ganglion kafatası bulunan ve yüz innerve ve üst solunum yolları vardır. boğumlu ganglionlar vagal afferentler bağırsak, kalp, akciğerler ve boyunca uzanır. solunum hızı, solunum yolu tahrişi ve öksürük reflekslerinin: boğumlu nöronlar gibi fonksiyonların çeşitli bir dizi kontrol eder. Bu durumda, anlaşılması ve işlevini değiştirmek için, hava yolu spesifik nöronal alt popülasyonlarının belirlenmesi ve izole edilmesi için çok önemlidir. Fare, hava yolları havayolu özgü boğumlu nöronun retrograd takibi için bir floresan tracer boya, Hızlı Mavi, maruzs. nodoz gangliyon parçalanır ve flöresanla aktive edilen hücre (FAC) ayırma boyası pozitif hücrelerin toplanması için kullanılır. Daha sonra, yüksek kaliteli ribonükleik asit (RNA) yeni nesil dizileme için boya pozitif hücreler elde edilir. spesifik nöronal gen ifadesi belirlenir bu yöntem havayolunu kullanarak.
Introduction
Somatosensoriyel sinirler termal, mekanik, kimyasal, hem endojen ve çevresel faktörlerden oluşan zararlı uyaranlara transduce. Bu afferent sinirlerin hücre gövdeleri arka kök, trigeminal veya nodoz gangliyon olarak, duyusal ganglia yer almaktadır. Her duyu ganglion vücudun belirli bölgeleri innervates ve o bölgedeki ayrı organ ve dokuları innerve hücreler içerir. Örneğin, dorsal kök gangliyon (DRG) Vertebral kolon bulunan ve trigeminal ganglion kafatası yer alırken hava yolları 1 üst yüz, gözler, meninksler veya innerve nöron içeren, gövde ve uzuvların boyunca süreçleri uzatmak, 2. Vagus sinirinin boğumlu ganglion alt solunum yolları ve akciğerleri 3 kafatası altındaki boyunda bulunan ve gastrointestinal sistem, kalp boyunca sinir liflerini uzatmak hücre gövdeleri içerir ve. İnsanlarda boğumlu ganglion, ancak fare birleştirildiği, tek başına duruyorAyrıca akciğerleri 4 innervates juguler gangliyon ile. Bu erimiş ganglion genellikle / juguler boğumlu karmaşık, vagus ganglion denilen, ya da sadece boğumlu ganglion 5 edilir. Burada, boğumlu gangliyon olarak adlandırılır.
boğumlu afferent lifler beyin sapındaki yalnız yolu (NTS) çekirdeğine iç organlardan gelen bilgi aktarmak. Bu eşsiz ganglion duyusal girdi böyle gut hareketindeki 6, kalp hızı 7, solunum 8,9 ve tahriş aktive solunum tepkiler 10,11 gibi işlevleri, çeşitli bir dizi kontrol eder. fonksiyonları ve innerve organların bu çeşitliliği sayesinde, hedef ve bireysel nöronal yolları araştırmak için boğumlu ganglion organ spesifik alt popülasyonlar ayırmak için kritik öneme sahiptir. Ancak, boğumlu küçük boyutu ve bu önemsiz bir görev değildir içeren nöronların sınırlı sayıda verilen. Ganglion nodoz Her fare yaklaşık 5.000 nöronlar 12 içerirUydu hücreleri destekleyici geniş bir nüfusa ek olarak. % 5 innervate solunum yollarında – 5000 boğumlu nöronlar, sadece 3. Dolayısıyla, solunum uyarılması veya patolojilere havayolu-innerve nöronların içinde herhangi bir fonksiyonel morfolojik veya moleküler değişiklikler, yoğun dolu boğumlu ganglion kaybolur.
Bu sorunu çözmek için, bir yöntem belirlemek ve hava yollarını innerve nöronlar izole etmek için geliştirilmiştir. üst solunum yolları takip eden innerve nodoz nöronların tespit etmek, bir floresanlı işaretleyici boya maruz bırakılmıştır. Hızlı Mavi nöronlar tarafından yakalandı ve en fazla sekiz hafta 13 korunur hücre gövdeleri hızla yolculuk oldu – 15. Bir kez nazik, henüz etkili, ayrışma protokol floresan aktif hücre (FAC) sıralamak için boya etiketleme ve hücre canlılığını korumak için kullanılan belirlendi. Kriteri hücrelerinin gen ekspresyonunu veya f belirlemek için, yüksek kaliteli ribonükleik asit (RNA) elde etmek için kullanılırveya diğer alt moleküler analizi. Bu protokol, ilgi konusu bir dokuda innerve duyusal nöronlar izole etmek için kullanışlı ve güçlü bir teknik sağlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, vagus sinirinin nodoz ganglionlarda hava yolu innerve nöronların hedeflemek için bir yöntemi anlatmaktadır. Bir kez etiketlenmiş, ganglionlar yavaşça optimum hücre sayıları ve canlılığı korumak için ayrışmış. Bu nöronlar FAC lizis tamponu doğrudan sıralanır ve RNA ayıklanır daha sonra. Bu protokolün önemi, hedef izole ve belirli duyusal hücre popülasyonunun kalitesini korumak için yeteneğidir. Gen ekspresyonu nöronların bu küçük nüfus anlatılan ve organa özel fonksiyo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH tarafından desteklenen sej için R01HL105635 verin. Yazarlar teknik danışmanlık için Diego V. Bohórquez teşekkür etmek istiyorum. Biz de teknik yardım için R. Ian Cumming teşekkür ve Duke İnsan Aşı Enstitüsü Araştırma Sitometrisi Paylaşımlı Kaynak Tesisi (Durham, NC) flow sitometri gerçekleştirmek. sitometri Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (adet UC6-AI058607) dan yapımı için kısmi destek aldı Duke Bölgesel biyosınırlılık Laboratuarında gerçekleştirilmiştir Akış.
Materials
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neurosciences. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neurosciences. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol – Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -. Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
