Marginating-간 백혈구의 선택적 수확
Summary
Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.
Abstract
Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.
Introduction
간 사인 곡선은 유기체에 중요한 다양한 면역 활동의 많은 백혈구 아형이 포함되어 있습니다. 예를 들어,도 덩이 세포로 알려진 간을 marginating (MH), 자연 살해 (NK) 세포, 특징 형태학 큰 과립 림프구 (LG 생명 과학)와 기능적으로 혈액 – 확립에 대하여 간 저항을 가능 자연 세포 독성 용량 백혈구뿐만 매개 종양 전이. 본 명세서에있어서의 목표는 중요한 독특한 세포 집단 (면역 함)을 연구하기 위해 MH 백혈구 선택적 수확을 가능하게하고, 이러한 특정 세포에 대한 각종 조작의 영향 (예 : 면역 활성)을 규명하는 것이다.
현상 원발 종양을 제거하는 면역 장애에도 불구하고, 암 환자 및 동물 모델에서의 증거는 면역계가 종양 세포, 미세 전이 및 throu 잔여 질병을 순환 제어 할 것을 지시GH 세포 매개 면역 (CMI). 그러나, 생체 내 기능과 인간에서 시험 관내 연구에서 가장자가 종양 세포는 순환 또는 비장 백혈구 1,2- 의한 세포 독성에 내성이 있음을 입증 동물, 이들 사이에 명백한 불일치가있다. 이러한 불일치는 별개 백혈구 모집단, 즉 marginating – 간 (정현파) 백혈구 활성화 NK 세포, 즉 세포 덩이 3들의 모집단의 생체 내 존재에 적어도 부분적으로 기인 할 수있다. 사실, 우리의 실험실에서 출판되지 않은 데이터는 F344 쥐에서 동계 종양 세포 순환 및 비장 백혈구에 내성이 발견되었다 (MADB106가), MH-NK 세포 (4)에 의해 용해 된 것으로 나타났다. 따라서, 순환 백혈구에 의심 "NK 내성"이다 종양 세포 MH-NK 세포에 의해 제어 될 수있다. 주목할만한, 마우스에서 MH-NK의 개선 활동은 면역 생체 내에서 다음 분명하다(폴리 I의 사용을 통해 예 : C 또는의 CpG-C) 자극 (5).
간 특정 NK 세포 (NK-MH)은 내피 세포 및 쿠퍼 세포 부착, 정현파 루멘 내부에 위치하고있다. MH-NK 세포는 단독으로 생리 활성 물질로서 7,8- 리소좀 효소 및 퍼포 granzymes와 같은 산성 포스파타제를 포함하는 조밀 한 구형 입자 및 막대 코어 드 소체 (6)을 특징으로한다. NK 세포를 순환과 비교하여, MH-NK 세포 과립 및 소포 9-11 높은 수 및 크기를 나타낸다. NK 세포 순환에 비해 염증 조건 MH-NK 세포, LFA-1 (12)의 더 높은 발현을 나타내는 것으로 나타났다. 이러한 향상된 발현 MH-NK 세포는 NK 세포 13,14 순환 비해 특정 종양 세포에 대해 세포 독성 더있는 메커니즘을 구성 할 수도있다. nterestingly, 인터루킨 (IL) -2와 시험 관내 인큐베이션에 따라, MH-NK 세포가 확대되고,자신의 번호와 과립의 크기는 프로 Fi를 제작 림 포카 인 활성화 킬러의 (LAK) 세포 (15)와 일치 모두 증가.
액티브 MH 백혈구 독점적 그라인딩과 조직의 생물학적 분해에 기초하는 표준 간 백혈구 수확하는 방법을 통해 얻어 질 수 없다. 본원에 기술 된 우리 관류 방법은 표준 방법에 비해 두 가지 장점을 갖는다. 우선, 관류 방법은 선택적으로 다른 간 구획에서 다른 백혈구에 의한 오염을 방지 MH 백혈구를 수확. 조직 처리 손상 세포 것을 접근하거나 형태를 변경하고, 조직 손상으로 인해 현저 면역 조절 다양한 인자의 방출을 유도 달리 둘째, 더 관류 기술, 무결성, 활동, 및 MH 백혈구의 생리적 환경 보존 활동.
간은 암전 A에 대한 중요한 타겟 기관이다차 다양한 감염 16. MH 전지 고유 특성을 나타내는 바와 같이 이들 병변에 대해 다양한 조건에서이 특정 인구를 연구하는 것이 중요하다. 예를 들어, 다양한하는 BRM에 의한 전신 면역 활성화를주의하는 가치가있다 (예를 들면 폴리 I : C 또는의 CpG-C)가 백혈구 5 순환보다 MH-백혈구 더 활성화하는 것으로 나타났다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 명세서 간 관류 방법은 선택적 수확 할 수 있으며 간 백혈구 marginating의 고유 인구 공부. 또한 피트 셀 3이라고 간 NK 세포, 간장 정현파에있는 독특한 NK 세포군을 구성한다. 그들은 쥐, 마우스 (17)과 인간 (18, 19)에서 발견된다. 절연 주변 NK 세포에 비해 피트 셀 작은 세포질 과립 (20)의 더 많은 수, 및 LFA-1 (12) 표면 항원의 이상 발현이 나타났다, YAC-1 및 CC53…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van’t Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. A central role of perforin in cytolysis?. Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. . , (2015).
