Marginating-肝白血球の選択的ハーベスティング
Summary
Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.
Abstract
Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.
Introduction
肝臓の正弦波は、生物にとって重要な種々の免疫活動の多数の白血球サブタイプが含まれています。例えば、また、ピット細胞として知られている肝をmarginating（MH）ナチュラルキラー（NK）細胞は、特徴づけされているとして形態学的に大顆粒リンパ球（LGLS）と機能的に血液の確立に対する肝臓の抵抗を可能に自発的な細胞傷害能を有する白血球、など負担腫瘍転移。本明細書に提示された方法の目標は、この重要かつユニークな細胞集団（および免疫コンパートメント）を研究するため、およびこれらの特定の細胞上の各種操作（ 例えば免疫活性化）の影響を解明するために、MHの白血球の選択的ハーベスティングを可能にすることです。
現像原発腫瘍を除去する免疫不全にもかかわらず、癌患者および動物モデルにおける証拠は、免疫系が腫瘍細胞、微小転移、およびthrou残存疾患、循環制御できることを示していますGH細胞性免疫（CMI）。しかし、これらのインビボでの機能の間の証明ヒトおよび動物のin vitro研究で明らかな矛盾があるほとんどの自己腫瘍細胞は、1,2-循環または脾臓白血球による細胞毒性に対して耐性があること。この矛盾は、別個の白血球亜集団、すなわちmarginating、肝臓（正弦波）白血球および活性化NK細胞、すなわちピットセル3のそれらの亜集団のin vivoで存在する、少なくとも部分的に帰することができます。実際、我々の研究室からの未発表データは、F344ラットに同系腫瘍細胞循環および脾臓白血球に耐性が認められた（MADB106）は、MH-NK細胞4によって溶解させたことを示しました。したがって、循環白血球に伝えられるところでは、「NK抵抗性」である腫瘍細胞をMH-NK細胞によって制御されてもよいです。注目すべきは、マウスにおいて、MH-NK活性の増強は、免疫in vivoで次明らかです刺激（ 例えば 、ポリIの使用により：CまたはCpG-C）5。
肝臓特異的NK細胞（MH-NK）は、内皮細胞およびクッパー細胞に付着し、正弦波の内腔の内側に位置しています。 MH-NK細胞はもっぱら生理活性物質7,8としてリソソーム酵素、およびパーフォリン及びグランザイムなどの酸性ホスファターゼを含む球状密顆粒およびロッド芯小胞6、によって特徴付けられます。 NK細胞の循環と比較して、MH-NK細胞は、顆粒及び小胞9-11のより高い数と大きさを示します。 NK細胞の循環と比較して、炎症状態下で、MH-NK細胞は、LFA-1 12のより高い発現を示すことが示されました。この増強された発現は、MH-NK細胞はNK細胞13,14を循環するよりも、特定の腫瘍細胞に対してより細胞傷害性であることにより、機構を構成している可能性があります。 nterestingly、インターロイキン（IL）-2 でビトロインキュベーション後、MH-NK細胞が肥大、およびプロFiのルリンホカイ ン活性化キラー（LAK）細胞15のと一致しているすべてのそれらの顆粒の増加の彼らの数とサイズ、。
アクティブMH白血球は、排他的に粉砕し、組織の生物学的分解に基づいており、標準的な肝白血球の収穫方法、を介して取得することはできません。本明細書中に記載の当社の灌流アプローチは、標準的なアプローチと比較して、2つの大きな利点があります。まず、灌流アプローチは、選択的に他の肝臓の区画から他の白血球による汚染を防止し、MHの白血球を収穫します。第二に、灌流技術は、より良い組織処理は、その損傷細胞に接近またはその形態を変化させるとは異なり、完全性、活性、およびMH白血球の生理的な環境を維持し、組織の損傷に起因する、著しく免疫調節種々の因子の放出を誘発しますアクティビティ。
肝臓は、癌転移aの主要な標的器官でありますさまざまな感染症の16回目。 MH電池は、ユニークな特徴を示すように、これらの病変に対して様々な条件の下で、この特定の集団を研究することが重要です。例えば、それは様々なのBRMによって、その全身の免疫活性化に注意することは価値がある（ 例えば、ポリI：CまたはCpG-C）は、白血球5を循環させるよりもMH-白血球より多くを活性化することが示されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に提示肝灌流法は、肝白血球をmarginatingのユニークな人口の選択的ハーベスティングと勉強を可能にします。またピットセル3と呼ばれる肝臓のNK細胞は、肝臓の類洞に存在する独特のNK細胞集団を構成しています。それらは、ラット、マウス17およびヒト18,19に見出されます。単離された末梢NK細胞と比較して、ピット細胞は、LFA-1の12のように、より小…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
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