बीएमपी विरोधी Grem2 का प्रयोग pluripotent स्टेम सेल से अलिंद cardiomyocytes के भेदभाव
Summary
Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
Abstract
स्टेम कोशिकाओं से cardiomyocytes की आबादी पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किया गया है, लेकिन ये आम तौर पर मिश्रित phenotypes की कोशिकाओं निकलेगा। विशिष्ट myocyte उपप्रकार को शामिल पढ़ाई में दिलचस्पी शोधकर्ताओं ने एक अधिक निर्देशित भेदभाव दृष्टिकोण की आवश्यकता है। Grem2, एक स्रावित बीएमपी प्रतिपक्षी विवो में आलिंद चैम्बर गठन के लिए आवश्यक है कि के साथ माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ते) का इलाज करके, एक आलिंद phenotype के साथ हृदय कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या उत्पन्न किया जा सकता है। इंजीनियर Myh6-DsRed-Nuc स्टेम सेल लाइन का उपयोग पहचान, चयन, और cardiomyocytes की शुद्धि के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में embryoid निकायों फांसी ड्रॉप विधि का उपयोग Myh6-DsRed-Nuc कोशिकाओं से उत्पन्न होता है और भेदभाव दिन 4 (D4) तक निलंबन में रखा जाता है। D4 कोशिकाओं को Grem2 के साथ इलाज किया और जिलेटिन लेपित प्लेटों पर चढ़ाया जाता है। बीच D8-D10 बड़े करार क्षेत्रों और संस्कृतियों में मनाया जाता है और विस्तार करने के लिए जारी कर रहे हैं MD14 के माध्यम से ature। आण्विक, ऊतकीय और electrophysiogical विश्लेषण से संकेत मिलता Grem2 इलाज कोशिकाओं में कोशिकाओं आलिंद की तरह आलिंद cardiomyocytes के जीव विज्ञान और विभिन्न औषधीय एजेंटों के लिए उनकी प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल उपलब्ध कराने विशेषताओं के अधिग्रहण।
Introduction
स्टेम कोशिकाओं को पैदा करने और कोशिकाओं को विशेष रूप से मानव 1-5 में बुनियादी अनुसंधान और पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए उपयोग करने के लिए मुश्किल ऊतकों की एक मेजबान से अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं। विकास के संकेत दे रास्ते के समुचित मॉडुलन वांछित प्ररूपी भाग्य के लिए स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव प्रत्यक्ष कर सकते हैं। कई प्रोटोकॉल स्टेम कोशिकाओं 6-14 से cardiomyocytes (सीएम) उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया है। इन प्रोटोकॉल आम तौर पर TFGβ superfamily (Activin, बीएमपी, और TGFβ) और Wnt बहिर्जात वृद्धि कारक है और / या छोटे अणुओं 10,12-15 के समय पर इसके माध्यम से रास्ते के मॉडुलन शामिल है। इन प्रोटोकॉल कोशिकाओं है कि मुख्यमंत्रियों बनने का प्रतिशत बढ़ाने के आम तौर पर प्रभावी रहे हैं, लेकिन विशिष्टता की कमी है, आलिंद, वेंट्रिकुलर, और नोडल / चालन प्रणाली प्रजातियों का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी पैदा होता है। विशिष्ट हृदय अध्ययन करने के लिए एक अधिक निर्देशित भेदभाव appro उपप्रकारACH आवश्यक है।
Gremlin2 (Grem2, यह भी कहा जाता प्रोटीन दान और Cerberus या PRDC कम करने के लिए से संबंधित) एक स्रावित बीएमपी प्रतिपक्षी zebrafish 16 में हृदय के विकास के दौरान उचित हृदय भेदभाव और आलिंद चैम्बर गठन के लिए आवश्यक है। भेदभाव दिन 4 में Grem2 के साथ फर्क भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के इलाज, बस mesodermal मार्कर टी Brachyury और 1 की तरह Cerberus के शिखर अभिव्यक्ति के बाद, सीएमएस की पैदावार बढ़ जाती है और आलिंद वंश 14 के मुख्य रूप से कोशिकाओं का एक पूल उत्पन्न करता है।
संयोजक Grem2 फर्क कोशिकाओं के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है और मानक प्रोटीन के उत्पादन की तकनीक 17 का उपयोग किया जा सकता है या व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है। यह जलीय समाधान में अत्यधिक घुलनशील है और वांछित समय बिंदु पर संस्कृतियों के लिए exogenously जोड़ा जा सकता है।
भेदभाव RT-qPCR का उपयोग कर मार्करों प्रतिनिधि की अभिव्यक्ति यों तो लगाया जा सकता हैहृदय progenitors, हृदय progenitors, और प्रतिबद्ध मुख्यमंत्रियों की। इम्यूनोफ्लोरेसेंस भी पहचान करने और हृदय प्रकार की कोशिकाओं के स्थानिक वितरण कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
अनुप्रयोग है कि शुद्ध आबादी की आवश्यकता होती है और अधिक आसानी से जब एक संवाददाता प्रणाली का उपयोग करते हुए की पहचान करने और मुख्यमंत्रियों को अलग-थलग करने के लिए किया जाता है। इस प्रयोजन के लिए, हम αMHC-DsRedNuc माउस CGR8 ते सेल लाइन का निर्माण 14 में शुरू की है। CGR8 कोशिकाओं के विकास और फीडर कोशिकाओं के बिना pluripotent रहते हैं, विस्तार और भेदभाव assays 18 की सुविधा। ते सेल लाइन हृदय-विशिष्ट अल्फा मायोसिन भारी चेन (एमएचसी या Myh6 α) जीन प्रमोटर के तहत एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत के साथ एक DsRed फ्लोरोसेंट प्रोटीन कोडिंग अनुक्रम में शामिल है। इन कोशिकाओं का उपयोग करना, सीएमएस आसानी से पहचान की और मात्रा का ठहराव, सेल छँटाई, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, दवा स्क्रीन, आलिंद और भेदभाव के तंत्र के अध्ययन के लिए अलग किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल नियमित तौर पर मुख्यमंत्रियों के एक उच्च प्रतिशत है कि आलिंद वंश के लक्षण हैं के साथ संस्कृतियों पैदा करता है। किसी भी भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, mESCs भेदभाव करने से पहले की गुणवत्ता …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच अनुदान HL083958 और HL100398 (AKH) और 2T32HL007411-33 द्वारा समर्थित किया गया था "हृदय तंत्र में कार्यक्रम: जांच में प्रशिक्षण" (जेबी)।
Materials
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
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