Différenciation des atrial cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes Utilisation de la BMP Antagonist Grem2

Résumé

La génération de cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes in vitro permet d’accéder à de grandes quantités de tissu cardiaque in vitro pour la science fondamentale et les applications cliniques. Ce protocole utilise le facteur d’essai Grem2 pour augmenter le nombre de cardiomyocytes obtenus et pour générer des cardiomyocytes avec un phénotype auriculaire.

Résumé

Les protocoles pour produire des populations de cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes ont été développés, mais ceux-ci donnent généralement des cellules de phénotypes mixtes. Les chercheurs intéressés à poursuivre des études impliquant des sous-types de myocytes spécifiques nécessitent une approche de différenciation plus dirigée. Par traitement de souris souches embryonnaires (ES) avec des cellules Grem2, un antagoniste de BMP sécrétées qui est nécessaire pour la formation de la chambre auriculaire in vivo, un grand nombre de cellules cardiaques avec un phénotype auriculaire peut être généré. L'utilisation de la lignée de cellules souches conçu Myh6-DsRed-NUC pluripotentes permet l'identification, la sélection et la purification des cardiomyocytes. Dans ce protocole corps embryoïdes sont générés à partir de cellules Myh6-DsRed-NUC selon la méthode de goutte suspendue et maintenues en suspension jusqu'à ce jour de différenciation 4 (d4). A cellules d4 sont traités avec Grem2 et étalées sur des plaques de gélatine revêtues. Entre d8-d10 grandes surfaces contractantes sont observées dans les cultures et continuent de se développer et mature par d14. Moléculaire, des analyses histologiques et electrophysiogical indiquent les cellules dans les cellules Grem2 traitées acquièrent des caractéristiques atriaux comme fournissant un modèle in vitro pour étudier la biologie des cardiomyocytes auriculaires et leur réponse à divers agents pharmacologiques.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes sont un outil puissant pour générer et étudier les cellules à partir d' une multitude de tissus difficiles à l'accès à des études de recherche et pré-cliniques de base, en particulier chez les humains ^1-5. la modulation appropriée des voies de signalisation de développement peut diriger la différenciation des cellules souches pluripotentes au sort phénotypique souhaitée. De nombreux protocoles ont été développés pour générer des cardiomyocytes (SGC) à partir de cellules souches pluripotentes ^6-14. Ces protocoles comportent généralement une modulation de la superfamille TFGβ (activine, BMP et TGF) et les....

Protocole

1. Préparation de la cellule Culture Media, Solutions et réactifs.

1. Préparer 500 ml de souris les cellules souches embryonnaires (Mesc) supports par mélange et filtration stérile (0,2 um de taille des pores) 445 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 50 ml inactivé par la chaleur du sérum de fœtus bovin (FBS), 5 ml 100X concentrée L- remplacement de la glutamine, 5 ul de souris recombinante leucémie facteur inhibiteur (LIF) à 1 x 10 ⁷ unités par ml et 1,43 ul de ß-mercaptoéthanol (concentration finale 50 uM). Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
2. Préparer 500 ml de embryoïdes Body (EB) médias de différenciation par mélange et ....

Résultats

Avant la différenciation, les cellules souches pluripotentes doivent être compact et sans différenciation spontanée. Les cellules représentées sur la figure 1A sont prêts à être utilisés singularisé et pour accrocher des gouttes , comme décrit dans la section 5.1 du protocole. Les cellules représentées sur la figure 1B sont spontanément différenciation et ne doivent pas être utilisés pour la préparation des gouttes suspendues.

Discussion

Ce protocole produit régulièrement des cultures avec un pourcentage élevé de CMs qui sont caractéristiques de la lignée auriculaire. Comme avec n'importe quel protocole de différenciation, la qualité des mESCs avant la différenciation méritent une attention particulière. mESCs doivent être surveillés régulièrement pour la morphologie correcte (figure 1A). Toute différenciation spontanée qui se produit avant la formation de EbS limiter sévèrement l'efficacité des cardiogenèse et doit être enlevé .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
GMEM	Life Technologies	11710
FBS	Life Technologies	10082
Glutamax	Life Technologies	35050
LIF	EMD Millipore	ESG1107
ß ;-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
IMDM	Sigma	I3390
Acides aminés non essentiels	Sigma	M7145
10 cm Plaques de culture tissulaire	Sarstedt	83.3902
10 cm Boîtes de Pétri bactériennes	VWR	25384-342
6 cm Boîtes de Pétri bactériennes	VWR	25384-092
Plaques de culture tissulaire 6 puits	Sarstedt	83.3920
Gremlin 2 protéine recombinante	R& ampère; D Systems	2069-PR-050
Unités de filtration stériles	Thermo Fisher	09-741-02
Gélatine (à partir de peau de porc)	Sigma	G1890
10X PBS, Stérile	Sigma	P5493
BSA  ;	Sigma	5470
0,05 % Trypsine-EDTA solution	Life Technologies	25300054
DPBS, sans calcium, sans magnésium	Life Technologies	14200