Differenziazione dei atriale cardiomiociti dalle cellule staminali pluripotenti utilizzando la BMP Antagonista Grem2
Summary
Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
Abstract
Protocolli per la generazione di popolazioni di cardiomiociti dalle cellule staminali pluripotenti sono state sviluppate, ma questi in genere produrre cellule di fenotipi misti. I ricercatori interessati a perseguire studi condotti su specifici sottotipi miociti richiedono un approccio più diretto differenziazione. Trattando staminali embrionali (ES) cellule di topo con Grem2, un antagonista BMP secreta che è necessario per la formazione camera atriale in vivo, un gran numero di cellule cardiache con un fenotipo atriale può essere generato. L'utilizzo della linea di cellule staminali pluripotenti Myh6-DsRed-Nuc ingegnerizzato permette l'identificazione, la selezione e la purificazione dei cardiomiociti. In questo protocollo corpi embrionali sono generati dalle cellule Myh6-DsRed-Nuc utilizzando il metodo goccia e mantenute in sospensione fino differenziazione giorno 4 (D4). A cellule d4 sono trattati con Grem2 e placcato su piastre rivestite di gelatina. Tra D8-D10 grandi aree contraenti si osservano nelle culture e continuano ad espandersi e mtura attraverso d14. Molecolare, analisi istologiche e electrophysiogical indicano le cellule in cellule Grem2-trattati acquisiscono caratteristiche atriale-like che forniscono un modello in vitro per studiare la biologia dei cardiomiociti atriali e la loro risposta a vari agenti farmacologici.
Introduction
Le cellule staminali pluripotenti sono un potente strumento per la generazione e lo studio delle cellule da una miriade di difficoltà ai tessuti di accesso per ricerche e studi pre-clinici di base, in particolare negli esseri umani 1-5. Una corretta modulazione delle vie di segnalazione di sviluppo in grado di dirigere la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti al destino fenotipica desiderata. Molti protocolli sono stati sviluppati per generare cardiomiociti (CMS) a partire da cellule staminali pluripotenti 6-14. Questi protocolli comportano generalmente la modulazione di TFGβ superfamiglia (Activin, BMP e TGFβ) e percorsi attraverso temporizzata aggiunta di fattori di crescita esogeni e / o piccole molecole Wnt 10,12-15. Questi protocolli sono generalmente efficace ad aumentare la percentuale di cellule che diventano CMs, ma mancano di specificità, generando una popolazione mista di cellule che rappresentano linee atriale, ventricolare e sistema nodale / conduzione. Al fine di studiare cardiaco specifico sottotipi A appro differenziazione più direttoè necessario ach.
Gremlin2 (Grem2, chiamato anche proteine correlate a Dan e Cerberus o PRDC in breve) è un antagonista BMP secreto che è necessario per una corretta differenziazione cardiaca e la formazione da camera atriale durante lo sviluppo cardiaco in zebrafish 16. Trattare differenziazione delle cellule staminali embrionali con Grem2 alla differenziazione giorno 4, subito dopo picco di espressione di marcatori mesodermici T-brachyury e Cerberus come 1, aumenta la resa della CM e genera un pool di cellule prevalentemente del lignaggio atriale 14.
Ricombinante Grem2 viene usato per trattare le cellule differenziazione e può essere realizzato con proteine standard di tecniche di produzione 17 o possono essere acquistati commercialmente. È altamente solubile in soluzioni acquose e possono essere aggiunte esogenamente per culture al punto di tempo desiderato.
La differenziazione può essere rintracciato tramite RT-qPCR per quantificare l'espressione di marcatori di rappresentantedei progenitori cardiovascolari, i progenitori cardiaci, e impegnato CMS. Immunofluorescenza può anche essere usato per identificare e visualizzare la distribuzione spaziale dei tipi di cellule cardiache.
Le applicazioni che richiedono popolazioni pure vengono più facilmente effettuate quando si utilizza un sistema reporter per identificare e isolare CM. A questo scopo, abbiamo introdotto il αMHC-DsRedNuc costrutto nella linea di cellule del mouse CGR8 ES 14. Cellule CGR8 crescono e restano pluripotenti senza cellule di alimentazione, facilitando saggi di espansione e differenziazione 18. La linea di cellule ES contiene una proteina fluorescente DsRed sequenza codificante con un segnale di localizzazione nucleare sotto l'alfa cardiaca-specifico miosina catena pesante (alfa Mhc o Myh6) promotore del gene. Utilizzando queste cellule, CMS può essere facilmente identificato e isolato per la quantificazione, l'ordinamento delle cellule, elettrofisiologia, schermi di droga, e lo studio dei meccanismi di differenziazione atriale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo produce ordinariamente culture con una elevata percentuale di CMS che sono caratteristici della stirpe atriale. Come con qualsiasi protocollo di differenziazione, la qualità delle mESCs prima di differenziazione dovrebbe essere data particolare attenzione. mESCs dovrebbero essere monitorati di routine per una corretta morfologia (Figura 1A). Qualsiasi differenziazione spontanea che si verifica prima della formazione di EB si limitano fortemente l'efficienza del cardiogenesis e dev…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzioni HL083958 e HL100398 (AKH) e 2T32HL007411-33 "Programmi in meccanismi cardiovascolari: Formazione in Investigation" (JB).
Materials
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
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