BMPアンタゴニストGrem2を使用した多能性幹細胞から心房心筋細胞の分化
Summary
Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
Abstract
多能性幹細胞からの心筋細胞の集団を生成するためのプロトコルが開発されてきたが、これらは一般に、混合表現型の細胞をもたらします。特定の筋細胞のサブタイプを含む研究を追求することに興味の研究者は、より多くの有向分化アプローチが必要。 Grem2、 インビボでの心房室形成するために必要な分泌BMPアンタゴニストによるマウス胚性幹（ES）細胞を処理することによって、心房表現型を有する心臓細胞の多数を生成することができます。操作MYH6-のDsRed-のNuc多能性幹細胞株の使用は、識別、選択、および心筋細胞の精製を可能にします。このプロトコルでは胚様体は、ハンギングドロップ法を用いて、MYH6-たDsRed-のNuc細胞から生成され、分化4日目（D4）まで懸濁状態に維持しました。 D4セルでGrem2で処理され、ゼラチンコーティングしたプレート上にプレーティング。 D8-D10大型契約エリア間の培養で観察し、拡大を続けるとメートルされていますD14を通してature。分子は、組織学的およびelectrophysiogical分析はGrem2処理細胞における細胞は、心房心筋細胞の生物学および様々な薬理学的薬剤に対するそれらの応答を研究するためのin vitroモデルを提供心房のような特徴を獲得示しています。
Introduction
多能性幹細胞は、特にヒト1-5に、基礎研究および前臨床研究のための組織にアクセスすることは困難での宿主から細胞を生成し、研究するための強力なツールです。発達シグナル伝達経路の適切な調節は、所望の表現型の運命への多能性幹細胞の分化を指示することができます。多くのプロトコルは、多能性幹細胞から心筋6-14（CMS）を生成するために開発されています。これらのプロトコルは、一般的にTFGβスーパーファミリー（アクチビン、BMP、およびTGFβ）およびWnt外因性の成長因子および/ または小分子10,12-15の時限添加による経路の調節を伴います。これらのプロトコルは、一般のCMとなる細胞の割合を増加させるのに有効であるが、心房、心室、及び結節/伝導系の系統を示す細胞の混合集団を生成し、特異性を欠きます。特定の心臓を研究するために、より導か分化アプロサブタイプACHが必要です。
Gremlin2（ダンと短いためケルベロスまたはPRDCに関連Grem2、とも呼ばれるタンパク質）は、ゼブラフィッシュ16で心臓発生時に適切な心臓分化および心房室形成するために必要な分泌BMPアンタゴニストです。ただ、中胚葉マーカーT-ブラキュリと1のようなケルベロスのピーク発現させた後、分化4日目にGrem2との差別化胚性幹細胞を処理する、のCMの歩留まりを向上させ、主に心房系統14の細胞のプールを生成します。
組換えGrem2は分化細胞を治療するために使用され、標準的なタンパク質生産技術17を用いて作製することができるか、または商業的に購入することができます。これは、水溶液中で高度に可溶性であり、所望の時点で培養物に外因的に添加されてもよいです。
分化マーカーの代表的な発現を定量するためにRT-定量PCRを使用して追跡することができます心臓血管前駆細胞、心臓前駆体、および確定のCM。免疫蛍光法は、心臓の細胞型の空間的な分布を特定し、可視化するために使用することができます。
CMを同定および単離するためのレポーター系を使用する場合、純粋な集団を必要とするアプリケーションは、より容易に行われます。この目的のために、我々はαMHC-DsRedNucはマウスCGR8 ES細胞株14内に構築し導入しています。 CGR8細胞が拡大および分化アッセイ18を容易に 、フィーダー細胞なしで成長し、多能性のままです。 ES細胞株は、遺伝子プロモーター（MHCまたはMYH6α）心臓特異的アルファミオシン重鎖の下で核局在化シグナルとDsRedの蛍光タンパク質をコードする配列が含まれています。これらの細胞を用いて、CMは容易に特定し、定量化、細胞選別、電気生理学、薬物スクリーニング、および心房分化のメカニズムを研究するため、単離することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、日常的に心房系統の特徴であるのCMの割合が高いと文化を生成します。任意の分化プロトコルと同様に、分化に先立ったmESCの品質は、特に注意を与えられるべきです。たmESCは、日常的に適切な形態（ 図1A）を監視する必要があります。前EBの形成に発生した自発的な分化が厳しく心臓の効率を制限すると（ 図1B）を継代する前に削除する必要があ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIHでサポートされていた「循環器病のメカニズムにプログラム：調査研修」HL083958とHL100398（AKH）と2T32HL007411-33を付与（JB）。
Materials
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
