Differensiering av atrieflimmer cardiomyocytes fra Pluripotent stamceller ved hjelp av BMP Antagonist Grem2

Summary

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

Abstract

Protokoller for å generere populasjoner av cardiomyocytes fra pluripotente stamceller har blitt utviklet, men disse gir generelt celler av blandede fenotyper. Forskere er interessert i å forfølge studier med spesifikke myocyte subtyper krever en mer rettet differensiering tilnærming. Ved å behandle mus embryonale stamceller (ES-celler) med Grem2, en utskilt BMP-antagonist som er nødvendig for atrial kammeret dannelse in vivo, kan et stort antall hjerteceller med en atrial fenotype bli generert. Bruk av konstruert Myh6-DsRed-Nuc pluripotent stamcellelinje muliggjør identifisering, utvelgelse, og rensing av cardiomyocytes. I denne protokollen embryoid kropper er generert fra Myh6-DsRed-NUC celler ved hjelp av den hengende slipp-metoden og holdt i suspensjon inntil differensiering dag 4 (d4). Ved D4 cellene behandles med Grem2 og sådd ut på gelatin-belagte plater. Mellom d8-D10 store entreprenør områdene er observert i kulturer og fortsette å utvide og mperaturen gjennom D14. Molekylær, histologiske og electrophysiogical analyser indikerer celler i Grem2-behandlede celler skaffe atrial-lignende egenskaper som gir en in vitro modell for å studere biologi av atriale kardiomyocytter og deres respons på forskjellige farmakologiske midler.

Introduction

Pluripotente stamceller er et kraftig verktøy for å generere og studere celler fra en rekke vanskelig å få tilgang til vev for grunnleggende forskning og pre-kliniske studier, spesielt hos mennesker ^1-5. Riktig modulering av utviklingssignalveier kan direkte differensiering av pluripotente stamceller til ønsket fenotypiske skjebne. Mange protokoller har blitt utviklet for å generere cardiomyocytes (CMS) fra pluripotente stamceller ^6-14. Disse protokollene som regel innebære modulering av TFGβ super (activin, BMP, og TGFp) og Wnt trasé gjennom tidsbestemt tillegg av eksogene vekstfaktorer og / eller små molekyler ^10,12-15. Disse protokollene er generelt effektive til å øke prosentandelen av celler som blir CMs, men mangler spesifisitet, generering av en blandet populasjon av celler som representerer atrial, ventrikulær og nodal / ledningssystem linjene. For å studere spesifikk hjerte subtyper en mer rettet differensiering approach kreves.

Gremlin2 (Grem2, også kalt Protein Relatert til Dan og Cerberus eller Prdc for kort) er en utskilt BMP antagonist som er nødvendig for riktig hjerte differensiering og atrial kammer formasjon under hjerte utvikling i sebrafisk ^16. Behandling differensierende embryonale stamceller med Grem2 på differensiering dag 4, like etter peak uttrykk for mesodermal markører T-Brachyury og Cerberus som en, øker utbyttet av CMS og genererer en pool av celler hovedsakelig av atrial avstamning ^14.

Rekombinant Grem2 brukes til å behandle de unike celler og kan gjøres ved hjelp av standard proteinproduksjonsteknikker ¹⁷ eller kan kjøpes kommersielt. Det er meget oppløselig i vandige oppløsninger og kan bli tilsatt eksogent til kulturene på det ønskede tidspunkt.

Differensiering kan spores ved hjelp RT-qPCR å kvantifisere uttrykk for markører representantav hjerte-stamfedre, hjertestamfedre, og engasjerte CMS. Immunfluorescens kan også brukes til å identifisere og visualisere romlig fordeling av hjertecelletyper.

Applikasjoner som krever rene populasjoner er lettere utført ved bruk av en reporter system for å identifisere og isolere CMS. For dette formålet, har vi innført αMHC-DsRedNuc konstruere i musen CGR8 ES cellelinje ^14. CGR8 celler vokse og forbli pluripotent uten mateceller, tilrettelegging for utvidelse og differensierings analyser ^18. ES cellelinje inneholder en DsRed fluorescerende proteinkodende sekvens med et kjernefysiske lokalisering signal under hjertespesifikke alpha Myosin Heavy Chain (a Mhc eller Myh6) genet promoter. Ved hjelp av disse cellene, kan CMs lett identifiseres og isoleres for kvantifisering, celle sortering, elektrofysiologi, narkotika-skjermer, og studere mekanismer for atrial differensiering.

Protocol

1. Utarbeidelse av Cell Culture Media, løsninger og reagenser. Forbered 500 ml Mouse embryonale stamceller (Mesc) medie ved å blande og steril filtrering (0,2 mikrometer porestørrelse) 445 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 50 ml varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS), 5 ml 100X konsentrert L- glutamin erstatning, 5 pl rekombinant mus leukemiinhiberende faktor (LIF) ved 1 x 10 7 enheter per ml og 1,43 ul ß-merkaptoetanol (endelig konsentrasjon er 50 uM). Oppbevar ved 4 ˚C til den …

Representative Results

Før differensiering, bør pluripotente stamceller være kompakt og fri for spontan differensiering. Cellene er vist i figur 1A er klar til å bli singularized og brukes til å henge dråper som beskrevet i 5.1 i protokollen delen. Cellene er vist på figur 1B er spontant differensiere og bør ikke brukes for fremstilling av hengende dråper. Panelene er inklu…

Discussion

Denne protokollen gir rutinemessig kulturer med en høy andel av CMS som er karakteristisk for atrial avstamning. Som med alle differensiering protokollen, må kvaliteten på mESCs før differensiering bli gitt spesiell oppmerksomhet. mESCs bør rutinemessig kontrolleres for riktig morfologi (figur 1A). Enhver spontan differensiering som inntreffer før dannelsen av EBS vil sterkt begrense effektiviteten av cardiogenesis og bør fjernes før aging (figur 1B). EB størrelse påvirker ogs…

Materials

GMEM	Life Technologies	11710
FBS	Life Technologies	10082
Glutamax	Life Technologies	35050
LIF	EMD Millipore	ESG1107
ß-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
IMDM	Sigma	I3390
Non-Essential Amino Acids	Sigma	M7145
10 cm Tissue Culture Plates	Sarstedt	83.3902
10 cm Bacterial Petri Dishes	VWR	25384-342
6 cm Bacterial Petri Dishes	VWR	25384-092
6-well tissue culture plates	Sarstedt	83.3920
Gremlin 2 recombinant protein	R&D Systems	2069-PR-050
Sterile filter units	Thermo Fisher	09-741-02
Gelatin (from porcine skin)	Sigma	G1890
10X PBS, Sterile	Sigma	P5493
BSA	Sigma	5470
0.05% Trypsin-EDTA solution	Life Technologies	25300054
DPBS, no Calcium, no Magnesium	Life Technologies	14200