Differentiering av Atrial Cardiomyocytes från pluripotenta stamceller med hjälp av BMP antagonist Grem2
Summary
Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
Abstract
Protokoll för att generera populationer av cardiomyocytes från pluripotenta stamceller har utvecklats, men dessa ger i allmänhet celler av blandade fenotyper. Forskare som är intresserade av att fullfölja studier med specifika myocyt subtyper kräver en mer riktad differentiering strategi. Genom att behandla mus embryonala stamceller (ES) -celler med Grem2, en utsöndrad BMP-antagonist som är nödvändig för förmakskammarbildning in vivo, kan genereras ett stort antal hjärtceller med en atriell fenotyp. Användning av konstruerade Myh6-dsRed-Nuc pluripotenta stamceller linje möjliggör identifiering, urval, och rening av hjärtmuskelceller. I detta protokoll embryoidkroppar genereras från Myh6-dsRed-Nuc celler med hängande släpp-metoden och hölls i suspension tills differentiering dag 4 (D4). Vid d4 cellerna behandlas med Grem2 och ströks ut på gelatinbelagda plattor. Mellan d8-D10 stora avtalsområden observeras i odlingarna och fortsätter att expandera och mratur genom d14. Molekyl, histologiska och electrophysiogical analyser visar celler i Grem2-behandlade celler förvärvar atriella liknande egenskaper som tillhandahåller en in vitro-modell för att studera biologi atriella kardiomyocyter och deras svar på olika farmakologiska medel.
Introduction
Pluripotenta stamceller är ett kraftfullt verktyg för att skapa och studera celler från en mängd svåråtkomliga vävnader för grundforskning och prekliniska studier, speciellt hos människor 1-5. Korrekt modulering av utvecklingssignalvägar kan styra differentieringen av pluripotenta stamceller till den önskade fenotypiska öde. Många protokoll har utvecklats för att generera cardiomyocytes (CMS) från pluripotenta stamceller 6-14. Dessa protokoll omfattar i allmänhet modulering av TFGβ super (Aktivin, BMP, och TGF) och Wnt vägar genom tidsinställd tillsats av exogena tillväxtfaktorer och / eller små molekyler 10,12-15. Dessa protokoll är i allmänhet effektiva på att öka andelen celler som blir CMS men saknar specificitet, genererar en blandad population av celler som representerar atrial, ventrikulära och nodal / ledningssystemets linjer. För att studera specifika hjärt subtyper en mer riktad differentiering lämpach krävs.
Gremlin2 (Grem2, även kallad protein besläktade med Dan och Cerberus eller PRDC för kort) är ett utsöndrat BMP-antagonist som är nödvändig för korrekt hjärtdifferentiering och förmakskammarbildning under hjärt utveckling i zebrafisk 16. Behandla differentierande embryonala stamceller med Grem2 vid differentiering dag 4, strax efter topp uttryck för mesodermala markörer T-Brachyury och Cerberus som en, ökar utbytet av CMS och genererar en pool av celler främst av förmaks härstamning 14.
Rekombinant Grem2 används för att behandla de differentierande cellerna och kan göras med användning av standardprotein produktionstekniker 17 eller kan köpas kommersiellt. Det är mycket lösliga i vattenlösningar och kan tillsättas exogent till kulturer vid önskad tidpunkt.
Differentieringen kan spåras med hjälp av RT-qPCR att kvantifiera uttryck av markörer representativaav hjärt progenitorceller, hjärt stamceller och engagerade CMS. Immunofluorescens kan också användas för att identifiera och visualisera rumsliga fördelningen av hjärtcelltyper.
Tillämpningar som kräver rena populationer är mer lätt genomföras vid användning av ett reportersystem för att identifiera och isolera CMS. För detta ändamål har vi infört αMHC-DsRedNuc konstruktionen i musen CGR8 ES cellinje 14. CGR8 celler växer och förblir pluripotenta utan matarceller, vilket underlättar expansion och differentiering analyser 18. ES-cellinjen innehåller en DsRed fluorescerande proteinkodande sekvens med en nukleär lokaliseringssignal under hjärtspecifika alfa myosin tung kedja (a Mhc eller Myh6) genpromotorn. Med hjälp av dessa celler, kan CM lätt identifieras och isoleras för kvantifiering, cellsortering, elektro, drogskärmar, och studera mekanismer för förmaks differentiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll rutinmässigt producerar kulturer med en hög andel av CMS som är kännetecknande för förmaks härstamning. Som med alla differentieringsprotokoll, bör kvaliteten på mESCs före differentiering ägnas särskild uppmärksamhet. mESCs bör rutinmässigt övervakas för korrekt morfologi (Figur 1A). Alla spontan differentiering som inträffar före bildandet av EBS kommer att allvarligt begränsa effektiviteten i kardiogenes och bör tas bort innan passage (Figur 1B). …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH bidrag HL083958 och HL100398 (AKH) och 2T32HL007411-33 "Program i Cardiovascular mekanismer: Träning i Investigation" (JB).
Materials
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
