La diferenciación de los cardiomiocitos auricular partir de células madre pluripotentes Uso del antagonista de BMP Grem2
Summary
Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
Abstract
Los protocolos para la generación de poblaciones de cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes se han desarrollado, pero estos generalmente producir células de fenotipos mixtos. Los investigadores interesados en seguir estudios con miocitos subtipos específicos requieren un enfoque más dirigido diferenciación. Por el tratamiento de células madre embrionarias de ratón (ES) con Grem2, un antagonista de BMP secretada que es necesario para la formación de cámara auricular in vivo, un gran número de células cardiacas con un fenotipo auricular se pueden generar. El uso de la línea de células madre pluripotentes MYH6-DsRed-Nuc, permite la identificación, selección y purificación de los cardiomiocitos. En este protocolo cuerpos embrionarios se generan a partir de células MYH6-DsRed-Nuc utilizando el método de la gota que cuelga y se mantienen en suspensión hasta que la diferenciación día 4 (D4). En las celdas D4 son tratados con Grem2 y se sembraron en placas recubiertas de gelatina. Entre D8-D10 grandes áreas contratantes se observan en las culturas y continúan expandiéndose ymATURALEZA través de d14. Molecular, análisis histológicos y electrophysiogical indican células en células tratadas con Grem2 adquieren características similares a auriculares proporcionan un modelo in vitro para estudiar la biología de los miocitos auriculares y su respuesta a diversos agentes farmacológicos.
Introduction
Las células madre pluripotentes son una herramienta poderosa para la generación y el estudio de células de una serie de tejidos difícil acceso para los estudios de investigación básica y pre-clínicos, especialmente en seres humanos 1-5. la modulación adecuada de las vías de señalización de desarrollo puede dirigir la diferenciación de células madre pluripotentes para el destino fenotípica deseada. Muchos protocolos se han desarrollado para generar cardiomiocitos (CMS) a partir de células madre pluripotentes 6-14. Estos protocolos implican generalmente la modulación de la superfamilia TFGβ (activina, BMP, y TGF) y las vías mediante la adición temporizada de factores de crecimiento exógenos y / o moléculas pequeñas 10,12-15 Wnt. Estos protocolos son generalmente eficaces en el aumento del porcentaje de células que se convierten en los CM, pero carecen de la especificidad, la generación de una población mixta de células que representan linajes auricular, ventricular y del sistema nodal / conducción. Con el fin de estudiar cardíaca específica subtipos A apro mayor diferenciación dirigidaSe requiere ACH.
Gremlin2 (Grem2, también llamada proteína relacionada con Dan y Cerberus o CRP para abreviar) es un antagonista BMP secretada que es necesario para la diferenciación cardiaca adecuada y la formación de cámara auricular durante el desarrollo cardiaco en el pez cebra 16. El tratamiento de la diferenciación de células madre embrionarias con Grem2 en días de diferenciación 4, justo después de pico de expresión de marcadores mesodérmicas T-brachyury y Cerberus como 1, aumenta el rendimiento de los CM y genera un conjunto de células predominantemente del linaje atrial 14.
Grem2 recombinante se utiliza para tratar las células que se diferencian y se puede hacer uso de las técnicas de producción de proteínas estándar de 17 o puede adquirirse comercialmente. Es muy soluble en soluciones acuosas y puede añadirse de forma exógena a los cultivos en el punto de tiempo deseado.
La diferenciación se puede seguir utilizando RT-qPCR para cuantificar la expresión de marcadores representantede progenitores de células progenitoras cardiovasculares, cardiacas y comprometida CM. Inmunofluorescencia también se puede utilizar para identificar y visualizar la distribución espacial de los tipos de células cardíacas.
Las aplicaciones que requieren poblaciones puras se llevan a cabo más fácilmente cuando se usa un sistema indicador para identificar y aislar los CM. Con este fin, hemos introducido la αMHC-DsRedNuc construcción en la línea celular de ratón CGR8 ES 14. CGR8 células crecen y mantienen su pluripotencia sin células alimentadoras, facilitando la expansión y diferenciación ensayos 18. La línea de células ES contiene una secuencia que codifica la proteína fluorescente DsRed con una señal de localización nuclear bajo la alfa-cardiaca específica de la miosina de cadena pesada (MHC alpha o MYH6) promotor del gen. El uso de estas células, los CM puede ser fácilmente identificado y aislado para la cuantificación, clasificación de células, electrofisiología, pruebas de drogas, y el estudio de los mecanismos de diferenciación de la aurícula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo produce rutinariamente cultivos con un alto porcentaje de los CM que son característicos del linaje auricular. Al igual que con cualquier protocolo de diferenciación, la calidad de los mESCs antes de la diferenciación se debe prestar especial atención. mESCs deben ser controlados rutinariamente por la morfología adecuada (Figura 1A). Cualquier diferenciación espontánea que se produce antes de la formación de EB, limitar considerablemente la eficiencia de cardiogénesis y debe ser …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones y HL083958 HL100398 (AKH) y 2T32HL007411-33 "Programa de Mecanismos cardiovasculares: Formación en Investigación" (JB).
Materials
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
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