人間の強膜の共焦点顕微鏡法を実行するために積層技術を用いて、
Summary
Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.
Abstract
強膜はカバーし、目を保護する密な結合組織です。これは、主に高密度のコラーゲン束（タイプI、III、IV、V、VI、及びVII）からなります。 、その自己蛍光、不透明さ、及び厚さは、共焦点顕微鏡法のために適切であることが見出されていません。免疫組織化学のためにパラフィンに包埋ホルマリン固定強膜を使用して、ここに提示されている1つの代替アプローチは、抗原回復のための組織を予熱する場合は特に、技術的な課題があります。強膜は、細胞及び血管の両方において比較的悪いため、大きな組織サンプルを使用することは、望む細胞を防ぎ、血管および他の解剖学的部位に関連し、その局在化を理解するのに役立つように調べました。共焦点顕微鏡下でより大きな組織サンプルの分析を可能にするために、積層技術は、強膜の薄層を作成するために行きました。 CD31血管およびリンパ管の内皮hyaluの結果の分析を以下のローナン受容体1（LYVE1）科学的な審査の承認が得られたために陽性細胞は、この方法の利点と限界が議論されています。
Introduction
強膜は、密性結合組織で構成されている、目を覆う硬質の外側の層です。それは、眼内の構造を保護し、眼内圧を維持するのに役立ちます。このように、強膜は、明確なビジョンのために不可欠です。これは、リンパ管1,2を欠いており、それによって、それとリンパのない眼の内部3-7との間に、外リンパのない境界線を形成しています。また、それによって腱と解剖学的類似性を共有し、外眼筋のための結合部位を提供します。 強膜は、主にI型コラーゲンの密な束で構成され、コラーゲンタイプIII、IV、V、VI、VIII 8,9及びエラスチン10,11のより小さい数を有するため、この組織は、免疫組織化学のために使用することは容易ではありません。
（1）表在血管新生した上強膜、結膜およびテノン嚢の下に発見され、側面と目に向けて：解剖学的に、強膜は、3つの主要な層に分離することができます電子バック軌道に直面して、目の。 （2）強膜間質、強膜の主要部分を、 （3）直接ブドウ膜の上に位置する薄い着色層であるラミナフスカ、。強膜に関する当社の解剖学的知識は、20 世紀の前半から主茎。当時、研究者は、主にインドのインク注入12と血管キャスティング13-15を使用して、血管系の解剖学を研究しました。その後、それは血管造影の研究16-19で調査しました。
その時以来、古い技術が改善されていると新しいものは、私たちは前の解剖学的知識を補完することができましたが開発されています。我々はリンパ血管内皮特異的なヒアルロン酸受容体1（LYVE1）20またはポドプラニン21のような信頼性のリンパマーカーを持っていたので、例えば、それは約10年となっています。共焦点顕微鏡は、異なるTIの解剖学的特徴を研究するための新たな可能性を提供しています目のssues。複数の汚れが細胞のマーカーを区別するための又は血管及び他の解剖学的構造に関連する細胞の局在のために使用されることが可能になります。サンプルはより大きなサイズのものであり、ときに特定の細胞型の検索では、私たちはサンプルをスキャンすることを可能にするとき、それは概要を説明します。 Zスタック技術を、共焦点顕微鏡は、100〜200マイクロメートルまでのサンプルのために使用することができます。強膜は、筋肉の挿入および後部磁極11で1ミリメートルの背後に0.3ミリメートルの厚さが異なります。その厚さと不透明さの両方のために、強膜は、伝統的な方法を用いた共焦点顕微鏡観察には適していません。
これを解決するには、強膜組織は、共焦点顕微鏡との分析を可能にするために積層しました。この技術は、人間の強膜の両方の生理学的および病理学的状況のより良い理解を得るために有用です。
Protocol
Representative Results
Discussion
人間の強膜を積層することは、この組織の共焦点顕微鏡検査を行う方法です。このプロセスにおける重要なステップは、組織を固定するための代わりホルマリンエタノールの使用です。代わりに、固定のためにホルマリンのエタノールを使用する場合に我々の経験では、より良好な結果が得られます。ブラントメスは、プロシージャを悪化させるし、避けるべきです。同様に、強膜の乾燥ま?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
German Research Foundation (FOR2240 “(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye” to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 “Joining Forces to Corneal Regeneration” (to CC).
Materials
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24x24mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a | |
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