Met behulp van een lamineren techniek om te presteren confocale microscopie van de Human Sclera
Summary
Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.
Abstract
De sclera is een dicht bindweefsel dat bedekt en beschermt het oog. Het bestaat hoofdzakelijk uit dichte bundels collageen (type I, III, IV, V, VI en VII). Door de autofluorescentie, ondoorzichtigheid en dikte, maar het is geschikt gebleken voor confocale microscopie. Een alternatieve benadering voor de hier gepresenteerde, die met formaline gefixeerd in paraffine ingebed sclera voor immunohistochemie gebruikt, heeft technische problemen, vooral wanneer het voorverwarmen weefsel voor antigen herstel. Omdat de sclera relatief arm aan beide cellen en vaten, werd het gebruik van grotere weefselmonsters onderzocht om te voorkomen uitzicht cellen en hun lokalisatie en vaartuigen en andere anatomische locaties begrijpen. Met het oog op de analyse van grotere weefselmonsters onder de confocale microscoop, werd een lamineertechniek uitgevoerd om dunne lagen van de sclera te maken. Naar aanleiding van de analyse van de resultaten van CD31 bloedvaten en lymfevaten endotheliale hyaluRonan receptor 1 (LYVE1) positieve cellen, waarvoor goedkeuring voor wetenschappelijk onderzoek werd verkregen, de voordelen en beperkingen van deze methode worden besproken.
Introduction
De sclera is de stijve buitenste laag dat het oog, die is gemaakt van dicht bindweefsel omvat. Het helpt om intraoculaire structuren beschermen en om intraoculaire druk te handhaven. Dus de sclera is essentieel voor helder zicht. Het mist lymfevaten 1,2 en vormt daardoor een buitenste lymfatische-vrije grens tussen deze en de lymfatische-binnenmantel eye 3-7. Het biedt ook bevestiging plaatsen voor oculaire spieren, waardoor de anatomische gelijkenissen delen met pezen. Omdat de sclera bestaat voornamelijk uit dichte bundels van type I collageen en heeft kleinere aantallen collageen type III, IV, V, VI, VIII en 8,9 elastine 10,11, dit weefsel is niet makkelijk te gebruiken voor immunohistochemie.
Anatomisch kan de sclera worden gescheiden in drie lagen: (1) de oppervlakkige gevasculariseerde episclera, vond onder het bindvlies en Tenon capsule en naar de zijkanten en ee achterkant van het oog met uitzicht op de baan; (2) de sclerale stroma, het grootste deel van de sclera; en (3) de lamina fusca, die een dunne, gepigmenteerde laag direct boven de uvea. Onze anatomische kennis over de sclera komt vooral voort uit de eerste helft van de 20e eeuw. Op dat moment, bestudeerden de anatomie van bloedvaten voornamelijk met Indische inkt injecties 12 en vasculaire gieten 13-15. Later, werd onderzocht in angiografische studies 16-19.
Sinds die tijd zijn de oudere technieken verbeterd en nieuwe ontwikkeld die hebben ons als aanvulling op eerdere anatomische kennis. Zo is het slechts tien jaar geleden dat we deze betrouwbare lymfatische markers als lymfatisch vasculair endothelium specifieke hyaluronan receptor-1 (LYVE1) 20 of podoplanin 21 hebben. Confocale microscopie biedt nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van de anatomische kenmerken van de verschillende tissues van het oog. Deze meerdere vlekken worden gebruikt voor het differentiëren van markers van cellen of voor de lokalisatie van cellen in verband met bloedvaten en andere anatomische structuren. Het geeft een overzicht wanneer het monster is van een groter formaat en stelt ons in staat om te scannen door middel van een steekproef bij het op zoek naar een specifiek type cel. Met Z-Stack-technologie, kan confocale microscopie worden gebruikt voor monsters tot 100-200 urn. De sclera verschilt in dikte van 0,3 mm achter de spier inserties en 1 mm in de achterpool 11. Omwille van zijn dikte en ondoorzichtigheid, de sclera is niet geschikt voor confocale microscopie met traditionele methoden.
Om dit te verhelpen, werden sclerale weefsels gelamineerd mogelijk te maken voor hun analyse met confocale microscopie. Deze techniek is nuttig voor een beter begrip van zowel fysiologische en pathologische situaties de menselijke sclera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lamineren van de humane sclera is een werkwijze voor het uitvoeren confocale microscopie op dit weefsel. Een kritische stap in dit proces is het gebruik van ethanol in plaats van formaline voor het aanbrengen van het weefsel. In onze ervaring, worden betere resultaten verkregen bij het gebruik van ethanol in plaats van formaline voor fixatie. Blunt scalpels verergeren de procedure en moet worden vermeden. Ook moet het opdrogen van de sclera worden vermeden, aangezien compliceert de procedure en vermindert de kwaliteit v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
German Research Foundation (FOR2240 “(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye” to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 “Joining Forces to Corneal Regeneration” (to CC).
Materials
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24x24mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a | |
References
- Schlereth, S. L., et al. Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).
- Schlereth, S. L., et al. Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera. Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).
- Hos, D., Cursiefen, C. Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).
- Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- Streilein, J. W. Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments. Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).
- Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen. J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).
- Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts. Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).
- Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. Characterization of collagen from normal human sclera. Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).
- Lee, R. E., Davison, P. F. Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit. Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).
- Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).
- Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. . The sclera. , (2012).
- Kiss, F. Der Blutkreislauf des Auges. Ophthalmologica. 106, 225 (1943).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).
- Ashton, N., Smith, R. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm’s canal. Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).
- Hayreh, S. S., Scott, W. E. Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti. Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).
- Virdi, P. S., Hayreh, S. S. Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study. Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).
- Bron, A. J., Easty, D. L. Fluorescein angiography of the globe and anterior segment. Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).
- Ikegami, M. Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author’s transl). Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
