באמצעות טכניקה למינציה לבצע Confocal מיקרוסקופית של האדם בלובן העין
Summary
Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.
Abstract
בלובן העין היא רקמת חיבור צפופה שמכסה ומגן על העין. זה מורכב בעיקר חבילות קולגן צפופות (סוגים אני, III, IV, V, VI, ו- VII). בשל autofluorescence, העמימות, והעובי שלה, זה לא נמצא מתאים מיקרוסקופיה confocal. גישה חלופית לזו שהוצגה כאן, אשר משתמשת בלובן העין קבוע בפורמלין מוטבע פרפין עבור אימונוהיסטוכימיה, יש אתגרים טכניים, במיוחד כאשר החימום המוקדם הרקמה לאחזור אנטיגן. מאז בלובן העין הוא דל יחסית בשני התאים וכלי, שימוש דגימות רקמה גדולות שנחקר כדי לסייע במניעת תאים המשקיפה ולהבין הלוקליזציה שלהם ביחס כלי ואתרי אנטומיים אחרים. כדי לאפשר הניתוח של דגימות רקמה גדולות תחת מיקרוסקופ confocal, טכניקת למינציה בוצעה ליצור שכבות דקיקות מן בלובן העין. בעקבות ניתוח התוצאות של כלי הדם CD31 ו hyalu אנדותל כלי הלימפהרונאן קולטן 1 (LYVE1) תאים חיוביים, לגביה אישור לבדיקה מדעית הושג, את היתרונות והמגבלות של שיטה זו הם דנו.
Introduction
בלובן העין היא השכבה החיצונית הנוקשה המכסה את העין, העשוי רקמת חיבור צפופה. זה עוזר להגן על מבנים תוך-עיני וכדי לשמור על לחץ תוך עיני. לפיכך, בלובן העין חיוני לראייה ברורה. זהו ללא כלי הלימפה 1,2 ובכך מהווה גבול חיצוני הלימפה ללא הבינה לבין העין הפנימית ללא הלימפה 3-7. הוא גם מספק אתרים מצורפים עבור שרירי extraocular וחולק דמיון אנטומי עם גידים. מכיוון בלובן העין מורכבת בעיקר צרורות צפופות של סוג אני קולגן יש מספרים קטנים של סוגי קולגן III, IV, V, VI, VIII 8,9 ואלסטין 10,11, רקמה זו אינה קלה לשימוש עבור אימונוהיסטוכימיה.
אנטומית, בלובן העין ניתן לחלק לשלוש שכבות עיקריות: (1) episclera vascularized השטחי, נמצאות מתחת הלחמית הקפסולה של שֶׁגֶם ולקראת הצדדים הבחזרה הדואר של העין מול מסלולו; (2) את stroma scleral, החלק העיקרי של בלובן העין; ו (3) את lamina fusca, המהווה שכבה דקה, פיגמנט ממוקם ישירות מעל עִנבִּיָה. הידע אנטומי שלנו על בלובן העין נובע בעיקר מן המחצית הראשונה של המאה ה -20. באותו זמן, חוקרים בדקו את האנטומיה של כלי דם בעיקר באמצעות זריקות דיו הודו 12 וכלי דם ליהוק 13-15. מאוחר יותר, זה נחקר במחקרים והאנגיוגרפית 16-19.
מאז אותה תקופה, שיטות ישנות שופרו חדשים פותח אפשרו לנו להשלים את הידע האנטומי קודם. לדוגמה, זה כבר רק יותר מעשור אחד מאז היו לנו סמנים הלימפה אמין כמו-1 קולטן hyaluronan ספציפי האנדותל של כלי הדם הלימפה (LYVE1) 20 או 21 podoplanin. מיקרוסקופיה Confocal מציעה אפשרויות חדשות ללימוד התכונות אנטומיות של ti השונהssues של העין. היא מאפשרת כתמים מרובים כדי לשמש להבחנת סמנים של תאים או עבור הלוקליזציה של תאים ביחס כלי דם מבנים אנטומיים אחרים. הוא מספק סקירה כאשר המדגם הוא בגודל גדול יותר ומאפשר לנו לסרוק באמצעות מדגם כאשר בחיפוש אחר סוג תא מסוים. בעזרת טכנולוגיה Z-Stack, מיקרוסקופיה confocal יכול לשמש דגימות עד 100-200 מיקרומטר. בלובן העין שונה בעובי בין 0.3 מ"מ מאחורי הוספות שרירים 1 מ"מ בקוטב האחורי 11. בשל הוא עובי השקיפות שלה, בלובן העין אינו מתאים מיקרוסקופיה confocal בשיטות מסורתיות.
כדי לתקן את זה, רקמות scleral היו למינציה כדי לאפשר ניתוח שלהם עם מיקרוסקופיה confocal. טכנולוגיה זו שימושית להשגת הבנה טובה יותר של שני מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים ב בלובן העין האנושית.
Protocol
Representative Results
Discussion
למינציה בלובן העין האנושית היא שיטה לביצוע במיקרוסקופ confocal על רקמה זו. שלב קריטי בתהליך זה הוא השימוש באתנול במקום פורמלין עבור הדבקת הרקמה. מניסיוננו, תוצאות טובות יותר מתקבלות כאשר באמצעות אתנול במקום פורמלין עבור קיבעון. אזמלים בלאנט להחמיר את ההליך וכן יש להימנע…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
German Research Foundation (FOR2240 “(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye” to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 “Joining Forces to Corneal Regeneration” (to CC).
Materials
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24x24mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a | |
References
- Schlereth, S. L., et al. Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).
- Schlereth, S. L., et al. Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera. Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).
- Hos, D., Cursiefen, C. Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).
- Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- Streilein, J. W. Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments. Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).
- Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen. J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).
- Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts. Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).
- Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. Characterization of collagen from normal human sclera. Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).
- Lee, R. E., Davison, P. F. Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit. Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).
- Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).
- Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. . The sclera. , (2012).
- Kiss, F. Der Blutkreislauf des Auges. Ophthalmologica. 106, 225 (1943).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).
- Ashton, N., Smith, R. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm’s canal. Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).
- Hayreh, S. S., Scott, W. E. Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti. Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).
- Virdi, P. S., Hayreh, S. S. Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study. Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).
- Bron, A. J., Easty, D. L. Fluorescein angiography of the globe and anterior segment. Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).
- Ikegami, M. Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author’s transl). Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
