मानव श्वेतपटल की Confocal माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने के लिए एक टुकड़े टुकड़े में तकनीक का प्रयोग
Summary
Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.
Abstract
श्वेतपटल एक घने संयोजी ऊतक कि कवर और आंख की रक्षा करता है। यह मुख्य रूप से घने कोलेजन बंडलों (प्रकार मैं, तृतीय, चतुर्थ, पंचम, षष्ठम, और सप्तम) के होते हैं। इसकी autofluorescence, opaqueness, और मोटाई के कारण, यह confocal माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त नहीं पाया गया है। जो, formalin तय श्वेतपटल immunohistochemistry के लिए पैराफिन में एम्बेडेड का उपयोग करता तकनीकी चुनौतियों का सामना किया है, खासकर जब प्रतिजन पुनः प्राप्ति के लिए ऊतक preheating यहाँ प्रस्तुत एक है, के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण। चूंकि श्वेतपटल दोनों कोशिकाओं और जहाजों में अपेक्षाकृत गरीब है, बड़ा ऊतकों के नमूनों के उपयोग अनदेखी कोशिकाओं को रोकने और जहाजों और अन्य संरचनात्मक साइटों के संबंध में उनके स्थानीयकरण को समझने में मदद करने के लिए पता लगाया था। confocal खुर्दबीन के नीचे बड़ा ऊतकों के नमूनों के विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए, एक laminating तकनीक श्वेतपटल से पतली परत बनाने के लिए किया गया था। CD31 रक्त वाहिकाओं और लसीका पोत endothelial hyalu के परिणामों के विश्लेषण के बादरोनन रिसेप्टर 1 (LYVE1) सकारात्मक कोशिकाओं है, जो के लिए वैज्ञानिक परीक्षा के लिए अनुमोदन प्राप्त किया गया था, फायदे और इस विधि की सीमाओं पर विचार-विमर्श कर रहे हैं।
Introduction
श्वेतपटल कठोर बाहरी परत है कि आंख है, जो घने संयोजी ऊतक से बना है शामिल किया गया है। यह intraocular संरचनाओं की रक्षा के लिए और intraocular दबाव बनाए रखने के लिए मदद करता है। इस प्रकार, श्वेतपटल स्पष्ट दृष्टि के लिए आवश्यक है। यह लसीका वाहिकाओं 1,2 से रहित है और इस तरह यह और लसीका-मुक्त भीतर की आंख 3-7 के बीच एक बाहरी लसीका-मुक्त सीमा रूपों। यह भी extraocular की मांसपेशियों के लिए लगाव साइटों प्रदान करता है, जिससे tendons के साथ शारीरिक समानता साझा। श्वेतपटल मुख्य रूप प्रकार मैं कोलेजन के घने बंडलों के होते हैं और कोलेजन प्रकार तृतीय, चतुर्थ, पंचम, षष्ठम, आठवीं 8,9 और इलास्टिन 10,11 की छोटी संख्या है क्योंकि, इस ऊतक immunohistochemistry के लिए उपयोग करने के लिए आसान नहीं है।
(1) सतही vascularized episclera, कंजाक्तिवा और चूल के कैप्सूल के नीचे पाया और पक्षों और वें की ओर: anatomically, श्वेतपटल तीन मुख्य परतों में विभाजित किया जा सकता हैआंख की कक्षा का सामना करना पड़ ई वापस; (2) scleral स्ट्रोमा, श्वेतपटल का मुख्य हिस्सा; और (3) पटल fusca है, जो एक पतली, रंजित सीधे uvea के ऊपर स्थित परत है। हमारे बारे में श्वेतपटल संरचनात्मक ज्ञान 20 वीं सदी की पहली छमाही से मुख्य रूप से उपजा है। उस समय, शोधकर्ताओं ने मुख्य रूप से भारत स्याही इंजेक्शन का उपयोग कर 12 और नाड़ी कास्टिंग 13-15 से वाहिका का शरीर रचना विज्ञान का अध्ययन किया। बाद में, यह angiographic अध्ययनों 16-19 में शोध किया था।
उस समय के बाद से, पुरानी तकनीक में सुधार किया गया है और नए लोगों को विकसित किया गया है कि हमें पिछले संरचनात्मक ज्ञान के पूरक के लिए अनुमति दी है। उदाहरण के लिए, यह केवल बारे में एक दशक के लिए किया गया है के बाद से हम के रूप में लसीका संवहनी endothelium विशिष्ट हयालूरोनान रिसेप्टर 1 (LYVE1) 20 या 21 podoplanin ऐसी विश्वसनीय लसीका मार्कर पड़ा है। Confocal माइक्रोस्कोपी अलग तिवारी की शारीरिक विशेषताओं के अध्ययन के लिए नई संभावनाओं प्रदान करता हैआंख की ssues। यह अनुमति देता है कई दाग के लिए कोशिकाओं के मार्कर के फर्क के लिए या रक्त वाहिकाओं और अन्य शारीरिक संरचनाओं के संबंध में कोशिकाओं के स्थानीयकरण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। यह एक सिंहावलोकन प्रदान करता नमूना एक बड़े आकार का है और जब एक विशिष्ट प्रकार की कोशिका की खोज में हमें एक नमूना के माध्यम से स्कैन करने की अनुमति देता है। Z ढेर तकनीक के साथ, confocal माइक्रोस्कोपी 100-200 माइक्रोन तक की नमूने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। श्वेतपटल मांसपेशियों सम्मिलन के पीछे 0.3 मिमी और पीछे ध्रुव 11 में 1 मिमी मोटाई के बीच में अलग है। दोनों इसकी मोटाई और opaqueness के कारण, श्वेतपटल confocal माइक्रोस्कोपी पारंपरिक तरीकों का उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं है।
इस उपाय, scleral ऊतकों confocal माइक्रोस्कोपी के साथ अपने विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए टुकड़े टुकड़े कर रहे थे। इस तकनीक का मानव श्वेतपटल में दोनों शारीरिक और रोग की स्थितियों की एक बेहतर समझ पाने के लिए उपयोगी है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव श्वेतपटल Laminating इस ऊतक पर confocal माइक्रोस्कोपी के प्रदर्शन के लिए एक विधि है। इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम इथेनॉल के बजाय ऊतक affixing के लिए formalin इस्तेमाल होता है। हमारे अनुभव में, बेहतर परिणाम जब निर्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
German Research Foundation (FOR2240 “(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye” to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 “Joining Forces to Corneal Regeneration” (to CC).
Materials
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24x24mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a | |
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