Utilizzando una tecnica di laminazione per l'esecuzione di Microscopia confocale della sclera umana
Summary
Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.
Abstract
La sclera è un tessuto connettivo denso che copre e protegge l'occhio. Essa consiste essenzialmente di fasci di collagene denso (tipo I, III, IV, V, VI, e VII). Grazie alla sua autofluorescenza, opacità e spessore, non è stato trovato adatto per la microscopia confocale. Un approccio alternativo a quello qui presentato, che utilizza sclera fissati in formalina inclusi in paraffina per immunoistochimica, ha problemi tecnici, in particolare per preriscaldare il tessuto per il recupero antigene. Dal momento che la sclera è relativamente povero di entrambe le cellule e dei vasi, l'uso di campioni di tessuto più grandi è stato esplorato per aiutare a prevenire le cellule che si affacciano e per capire la loro localizzazione in relazione alle navi e altri siti anatomici. Per consentire l'analisi di campioni di tessuto grandi al microscopio confocale, una tecnica di laminazione è stata eseguita per creare strati sottili dalla sclera. Dopo l'analisi dei risultati dei vasi sanguigni CD31 e vasi linfatici endoteliale hyaluRonan recettore 1 (LYVE1) cellule positive, per le quali è stato ottenuto l'approvazione per l'esame scientifico, i vantaggi ei limiti di questo metodo sono discussi.
Introduction
La sclera è lo strato esterno rigido che copre l'occhio, che è fatto di tessuto connettivo denso. Aiuta a proteggere le strutture intraoculari e di mantenere la pressione intraoculare. Così, la sclera è essenziale per una visione chiara. E 'privo di vasi linfatici 1,2 e, quindi, forma un bordo esterno libero-linfatica tra essa e l'occhio interiore senza linfatica 3-7. Esso fornisce inoltre i siti di attacco per i muscoli estrinseci, condividendo in tal modo somiglianze anatomiche con tendini. Poiché la sclera consiste principalmente di densi fasci di collagene di tipo I e ha un numero inferiore di collagene di tipo III, IV, V, VI, VIII 8,9 ed elastina 10,11, questo tessuto non è facile da usare per immunoistochimica.
Anatomicamente, la sclera può essere suddiviso in tre strati principali: (1) il superficiale episclera vascolarizzato, trovati sotto la congiuntiva e la capsula di tenone e verso i lati e the posteriore dell'occhio rivolto verso l'orbita; (2) stroma sclerale, la parte principale della sclera; e (3) il fusca lamina, che è un sottile strato pigmentato situato direttamente sopra la uvea. La nostra conoscenza anatomica sulla sclera deriva principalmente dalla prima metà del 20 ° secolo. A quel tempo, i ricercatori hanno studiato l'anatomia del sistema vascolare prevalentemente utilizzando iniezioni di inchiostro India 12 e vascolare fusione 13-15. Successivamente, è stato studiato in studi angiografici 16-19.
Da quel momento, le tecniche più vecchie sono state migliorate e nuove sono state sviluppate che ci hanno permesso di completare una precedente conoscenza anatomica. Ad esempio, è stato solo di circa un decennio da quando abbiamo avuto tali marcatori linfatici affidabili come linfatico vascolare acido ialuronico specifico recettore-1 (LYVE1) 20 o 21 podoplanin. La microscopia confocale offre nuove possibilità per lo studio delle caratteristiche anatomiche dei diversi tiUESTIONI dell'occhio. Esso consente più macchie da utilizzare per differenziare marcatori di cellule o per la localizzazione delle cellule in relazione ai vasi sanguigni e altre strutture anatomiche. Esso fornisce una panoramica quando il campione è di dimensioni maggiori e ci permette di scandiamo un campione quando alla ricerca di un tipo specifico di cellula. Con la tecnologia Z-Stack, microscopia confocale può essere utilizzato per i campioni fino a 100-200 micron. La sclera differisce di spessore tra 0,3 mm dietro le inserzioni muscolari e 1 mm al polo posteriore 11. A causa sia suo spessore e opacità, la sclera non è adatto per la microscopia confocale con metodi tradizionali.
Per rimediare a questo, i tessuti sclerali sono stati stratificati per consentire la loro analisi con microscopia confocale. Questa tecnologia è utile per una migliore comprensione di entrambe le situazioni fisiologiche e patologiche nella sclera umana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Laminazione la sclera umana è un metodo per eseguire la microscopia confocale in questo tessuto. Un punto critico in questo processo è l'uso di etanolo invece di formalina per l'apposizione del tessuto. Nella nostra esperienza, i risultati migliori si ottengono quando si utilizza etanolo invece di formalina per fissare. bisturi Blunt aggravano la procedura e deve essere evitato. Analogamente, il prosciugamento della sclera dovrebbe essere evitata, in quanto complica la procedura e riduce la qualità delle imma…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
German Research Foundation (FOR2240 “(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye” to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 “Joining Forces to Corneal Regeneration” (to CC).
Materials
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24x24mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a | |
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