Ved hjelp av en Laminering teknikk for å utføre Konfokalmikroskopi av Human Sclera

Summary

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

Abstract

Senehinnen er en tett bindevev som dekker og beskytter øyet. Den består hovedsakelig av kollagen tette bunter (typene I, III, IV, V, VI og VII). På grunn av sin autofluorescens, ugjennomskinnelighet, og tykkelse, har det ikke blitt funnet å være egnet for konfokal mikroskopi. En alternativ tilnærming til den som presenteres her, som bruker formalinfiksert sklera innstøpt i parafin for immunhistokjemi, har tekniske utfordringer, spesielt når forvarming av vev for antigenet gjenfinning. Siden sclera er forholdsvis fattig på begge cellene og fartøyer, ble bruken av større vevsprøver utforsket for å forhindre over-celler og for å forstå deres lokalisering i forhold til skip og andre anatomiske steder. For å tillate analyse av større vevsprøver under konfokale mikroskop, ble en lamineringsteknikk utført for å skape tynne lag fra senehinnen. Etter analyse av resultater av CD31 blodkar og lymfekar endothelial hyaluRonan reseptor 1 (LYVE1) positive celler, som ble innhentet godkjenning for vitenskapelig undersøkelse, fordeler og begrensninger av denne metoden blir diskutert.

Introduction

Senehinnen er det stive ytre lag som dekker øyet, som er laget av tett bindevev. Det bidrar til å beskytte intraokulære strukturer og for å opprettholde intraokulært trykk. Således er det sclera avgjørende for klart syn. Det er blottet for lymfekar ^1,2 og derved danner en ytre lymfatisk fritt grensen mellom det og det lymfatiske frie indre øye ^3-7. Det gir også festeplasser for extraocular muskler, og dermed dele anatomiske likheter med sener. Fordi sclera hovedsakelig består av tette bunter av type I kollagen og har et mindre antall av kollagen type III, IV, V, VI, VIII ^8,9 og elastin ^10,11, er dette vev ikke er lett å bruke for immunhistokjemi.

Anatomisk, kan sclera deles inn i tre hoved lag: (1) den overfladiske vaskularisert episclera, som finnes på undersiden av konjunktiva og tappen s kapsel og mot sidene og the bakre del av øyet som vender mot banen; (2) den skleral stroma, hoveddelen av sclera; og (3) lamina fusca, som er en tynn, pigmentert lag som ligger direkte over uvea. Vår anatomisk kunnskap om sclera stammer hovedsakelig fra første halvdel av det ^20. århundre. På den tiden forskerne studert anatomi av blodkar i hovedsak ved hjelp av tusj injeksjoner ¹² og vaskulær støping ^13-15. Senere ble det forsket på angiografiske studier ^16-19.

Siden den gang har eldre teknikker blitt forbedret, og nye har blitt utviklet som har tillatt oss å supplere tidligere anatomisk kunnskap. For eksempel har det bare vært om ett tiår siden vi har hatt slike pålitelige lymfatiske markører som lymfatisk vaskulærendotelet bestemt hyaluronan reseptor-1 (LYVE1) ²⁰ eller podoplanin ^21. Konfokalmikroskopi gir nye muligheter for å studere anatomiske trekk ved de forskjellige tissues i øyet. Det gir mulighet for flere flekker som skal brukes for å differensiere markører for celler eller for lokalisering av celler i forhold til blodkar og andre anatomiske strukturer. Det gir en oversikt når prøven er av større størrelse og gir oss mulighet til å søke gjennom en prøve når på jakt etter en bestemt celletype. Med Z-Stack teknologi, kan konfokal mikroskopi brukes for prøver opp til 100-200 um. Sclera forskjellig i tykkelse mellom 0,3 mm bak muskel innsettinger og en mm på bakre pol ^11. Både på grunn av sin tykkelse og ugjennomskinnelighet, er sclera ikke egnet for konfokal mikroskopi ved hjelp av tradisjonelle metoder.

For å bøte på dette, ble scleral vev laminert for å tillate sin analyse med konfokalmikroskopi. Denne teknologien er nyttig for å få en bedre forståelse av både fysiologiske og patologiske tilstander i det menneskelige sclera.

Protocol

Bruken av menneskelig vev må gjennomgås og godkjennes av en institusjonell gjennomgang bord eller tilsvarende. Arbeidet er beskrevet her ble godkjent av lokale etikkutvalg og hadde godkjenning for vitenskapelig undersøkelse. Dette arbeidet ble utført i henhold til Helsinkideklarasjonen. De menneskelige scleral prøver ble innhentet fra øynene til kloden givere (maks post-mortem tid 24 timer) på Eye Bank of Department of Ophthalmology, Universitetet i Köln, Tyskland. 1. Eksperimentell Forberedelse <l…

Representative Results

I representative eksperimenter utført her, er det påviselige fordeler som stammer fra bruken av denne spesielle lamineringsteknikk. Det første eksperimentet illustrerer mangfoldig nettverk av episcleral blodkar plexus i tre representative bilder (figur 3). Fartøyene er positive for CD31. Det andre eksperimentet viser immunceller, spesielt LYVE1 + celler av episclera og deres forhold til de CD31 positive bl…

Discussion

Laminering av det humane sclera er en fremgangsmåte for å utføre konfokal mikroskopi på dette vev. Et kritisk trinn i denne prosessen er anvendelse av ethanol i stedet for formalin for festing av vev. Vår erfaring er bedre resultater oppnås ved bruk av etanol i stedet for formalin for fiksering. Blunt skalp forverre prosedyren og bør unngås. Likeledes bør tørkingen opp av sclera unngås, fordi det kompliserer fremgangsmåten og reduserer kvaliteten av bildene.

Når det gjelder immu…

Materials

96% ethanol	Merck Chemicals, Darmstadt, Germany	P075.4
binocular stereo microscope	Motic, Hongkong, China	n.a
26G needles	Terumo, Leuven, Belgium	303800
15.5mm trepan	Geuder, Heidelberg, Germany	n.a
no.10 scalpel	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	2E+08
ophthalmic scalpel micro feather	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	no. 7657BR
CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)	Dako, USA	IR610
LYVE1 antibody  (polyclonal rabbit anti human)	Zytomed, Germany	RBK014-05
goat anti mouse FITC antibody	Sigma Aldrich, Steinheim, Germany	F0257
goat anti rabbit Cy3 antibody	Dianova, Germany	111-165-003
Goat Serum normal	Dako, Glostrup, Denmark	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335.1
microscope slides	Engelbrecht, Edermünde, Germany	WC7695002
Coverslips 24x24mm	Th. Gayer, Lohmar, Germany	7695026
DAKO fluorescent mounting medium	DAKO, USA	S3023
LSM Meta 510 confocal microscopy	Carl Zeiss AG, Jena, Germany	n.a