Использование ламинирование Методика Выполните конфокальной микроскопией Человеческой склеры
Summary
Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.
Abstract
Склеры является плотной соединительной ткани, которая покрывает и защищает глаза. Она в основном состоит из плотных коллагеновых пучков (типов I, III, IV, V, VI и VII). Благодаря своему автофлуоресцентной, непрозрачности и толщины, не было обнаружено подходит для конфокальной микроскопии. Альтернативный подход к приведенному здесь, который использует фиксированные формалином склеры заключали в парафин для иммуногистохимии, имеет технические проблемы, особенно когда предварительное нагревание ткани для извлечения антигена. Поскольку склеры относительно бедна в обоих клетках и сосудах, использование больших образцов ткани была исследована, чтобы помочь предотвратить клетки с видом и понять их локализацию в отношении судов и других анатомических участков. Для обеспечения анализа больших образцов ткани под конфокальной микроскопии, метод ламинирования была выполнена для создания тонких слоев из склеры. После анализа результатов CD31 кровеносных сосудов и сосудов лимфатической эндотелиальной hyaluРонан рецептора 1 (LYVE1) положительных клеток, для которых было получено разрешение на научной экспертизы, преимущества и недостатки этого метода обсуждаются.
Introduction
Склера жесткий внешний слой, который покрывает глаз, который сделан из плотной соединительной ткани. Это помогает защитить внутриглазных структур и для поддержания внутриглазного давления. Таким образом, склеры имеет важное значение для четкого видения. Она лишена лимфатических сосудов 1,2 и тем самым образует наружную лимфатическую свободной границы между ним и лимфатической свободной внутренней глаза 3-7. Она также обеспечивает места для прикрепления мышц глазного яблока, тем самым разделяя анатомических сходство с сухожилиями. Поскольку склера в основном состоит из плотных пучков типа I коллагена и имеет меньшее количество коллагена типа III, IV, V, VI, VIII 8,9 и эластина 10,11, эта ткань не является простым в использовании для иммуногистохимии.
Анатомически, склера могут быть разделены на три основные слои: (1) поверхностный васкуляризированной эписклеры, найденных под конъюнктиву и Теноновой капсулы и к сторонам и йе задней части глаза, обращенной к орбите; (2) Склеральное стромы, основная часть склеры; и (3) ламина fusca, которая представляет собой тонкий, пигментированный слой, расположенный непосредственно над сосудистой оболочки. Наше анатомическое знание о склеры проистекает главным образом из первой половины 20 – го века. В то время, исследователи изучали анатомию сосудистую систему, главным образом , с помощью тушью инъекций 12 и сосудистая литье 13-15. Позже он был исследован в ангиографических исследований 16-19.
С тех пор старые методы были улучшены, а новые были разработаны, которые позволили нам дополнить предыдущую анатомических знаний. Например, это только было около десяти лет , так как у нас были такие надежные маркеры лимфатическую как лимфатический эндотелий сосудов специфические гиалуронана рецептора-1 (LYVE1) 20 или podoplanin 21. Конфокальной микроскопии предлагает новые возможности для изучения анатомических особенностей различных тиОПРОСЫ глаза. Это позволяет несколько пятен, которые будут использоваться для дифференциации маркеров клеток или для локализации клеток по отношению к кровеносных сосудов и других анатомических структур. Это дает обзор, когда образец имеет больший размер и позволяет сканировать через образец, когда в поисках определенного типа клеток. С Z-Stack технологии, конфокальной микроскопии могут быть использованы для образцов до 100-200 мкм. Склеры отличается толщиной от 0,3 мм позади мышечных вставок и 1 мм на заднем полюсе 11. Благодаря своей толщине, так и непрозрачности, склеры не подходит для конфокальной микроскопии с использованием традиционных методов.
Чтобы исправить это, склеры ткани ламинируют, чтобы для их анализа с конфокальной микроскопии. Эта технология полезна для получения лучшего понимания как физиологических и патологических ситуаций в человеческом склеры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ламинирование человеческий склеры способ выполнения конфокальной микроскопии на этой ткани. Важным шагом в этом процессе является использование этанола вместо формалина для прикрепления ткани. По нашему опыту, лучшие результаты получаются при использовании этанола вместо формалин?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
German Research Foundation (FOR2240 “(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye” to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 “Joining Forces to Corneal Regeneration” (to CC).
Materials
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24x24mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a | |
References
- Schlereth, S. L., et al. Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).
- Schlereth, S. L., et al. Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera. Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).
- Hos, D., Cursiefen, C. Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).
- Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- Streilein, J. W. Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments. Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).
- Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen. J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).
- Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts. Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).
- Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. Characterization of collagen from normal human sclera. Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).
- Lee, R. E., Davison, P. F. Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit. Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).
- Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).
- Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. . The sclera. , (2012).
- Kiss, F. Der Blutkreislauf des Auges. Ophthalmologica. 106, 225 (1943).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).
- Ashton, N., Smith, R. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm’s canal. Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).
- Hayreh, S. S., Scott, W. E. Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti. Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).
- Virdi, P. S., Hayreh, S. S. Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study. Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).
- Bron, A. J., Easty, D. L. Fluorescein angiography of the globe and anterior segment. Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).
- Ikegami, M. Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author’s transl). Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
