Med hjälp av en lamineringsteknik att utföra konfokalmikroskopi av Human Sclera

Summary

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

Abstract

Sklera är en tät bindväv som täcker och skyddar ögat. Den består huvudsakligen av täta kollagenknippen (typ I, III, IV, V, VI och VII). På grund av dess autofluorescens, opacitet, och tjocklek, har det inte befunnits lämplig för konfokalmikroskopi. Ett alternativt tillvägagångssätt till det som presenteras här, som använder formalinfixerade sklera inbäddad i paraffin för immunohistokemi, har tekniska utmaningar, speciellt när förvärmning av vävnad för antigenåtervinning. Eftersom sklera är relativt dålig i båda cellerna och fartyg, var användningen av större vävnadsprover undersökas för att hjälpa till att förhindra utsikt celler och för att förstå deras lokalisering i förhållande till fartyg och andra anatomiska ställen. För att möjliggöra för analys av större vävnadsprover under konfokalmikroskop, var en lamineringsteknik utförs för att skapa tunna skikt från sklera. Efter analys av resultaten av CD31 blodkärl och lymfkärl endothelial hyaluRonan receptor 1 (LYVE1) positiva celler, för vilka godkännande för vetenskaplig undersökning erhölls, fördelar och begränsningar av denna metod diskuteras.

Introduction

Sklera är det styva yttre skiktet som täcker ögat, som är gjord av tät bindväv. Det bidrar till att skydda intraokulära strukturer och för att upprätthålla det intraokulära trycket. Således är sklera viktigt för tydlig vision. Det saknar lymfkärl ^1,2 och därigenom bildar en yttre lymfatiska fritt gränsen mellan den och det lymfatiska fria inre öga ^3-7. Det ger också fästställen för extraokulära muskler, och därigenom dela anatomiska likheter med senor. Eftersom sklera består huvudsakligen av täta knippen av kollagen typ I och har mindre antal kollagentyper III, IV, V, VI, VIII ^8,9 och elastin ^10,11, är denna vävnad inte lätt att använda för immunohistokemi.

Anatomiskt kan sklera separeras i tre huvudskikt: (1) den ytliga vaskulariserad episclera, som finns på undersidan av bindhinnan och Tenons kapsel och mot sidorna och the bakre delen av ögat mot omloppsbana; (2) den sklerala stroma, den huvudsakliga delen av sklera; och (3) lamina fusca, som är en tunn, pigmenterat skikt som ligger direkt ovanför uvea. Vår anatomiska kunskaper om sklera härrör huvudsakligen från första hälften av ^20-talet. På den tiden, forskare studerat anatomi kärl främst genom att använda tusch injektioner ¹² och vaskulär gjutning ^13-15. Senare blev det forskat i angiografiska studier ^16-19.

Sedan dess har äldre tekniker förbättrats och nya har utvecklats som har tillåtit oss att komplettera tidigare anatomiska kunskaper. Till exempel har det bara varit ungefär ett decennium sedan vi har haft sådana tillförlitliga lymfatiska markörer som lymfatiska kärlendotel specifik hyaluronan receptor-1 (LYVE1) ²⁰ eller podoplanin ^21. Konfokalmikroskopi erbjuder nya möjligheter för att studera de anatomiska egenskaperna hos olika tiFRÅGOR i ögat. Det gör det möjligt för flera fläckar som skall användas för att differentiera markörer för celler eller för att lokalisera celler i relation till blodkärlen och andra anatomiska strukturer. Den ger en översikt när provet är av en större storlek och ger oss möjlighet att skanna igenom ett prov när på jakt efter en specifik celltyp. Med Z-stack teknik kan konfokalmikroskopi användas för prover upp till 100-200 um. Sklera skiljer sig i tjocklek mellan 0,3 mm bakom muskelfästen och 1 mm vid den bakre stolpen ^11. På grund av både sin tjocklek och opacitet, är sklera inte lämplig för konfokalmikroskopi med hjälp av traditionella metoder.

För att råda bot på detta har sklerala vävnader laminerade för att möjliggöra deras analys med konfokalmikroskopi. Denna teknik är användbar för att få en bättre förståelse för både fysiologiska och patologiska situationer i människo sklera.

Protocol

Användningen av mänskliga vävnader skall granskas och godkännas av en Institutional Review Board eller motsvarande. Det arbete som beskrivs här har godkänts av lokala etiska kommittén och hade godkännande för vetenskaplig granskning. Arbetet utfördes enligt Helsingforsdeklarationen. De humana sklerala prover erhölls från ögon globe givare (max obduktion tid 24 timmar) vid ögonbank för avdelningen för oftalmologi vid universitetet i Köln, Tyskland. 1. Experimentell Beredning Förbered …

Representative Results

I representativa experiment som utförs här, det finns påvisbara fördelarna med att använda denna speciella lamineringsteknik. Det första experimentet visar de olika nätverk av episklerala blodkärls plexus i tre representativa bilder (Figur 3). Fartygen är positiva för CD31. Det andra experimentet visar immunceller, i synnerhet LYVE1 + celler i episclera och deras förhållande till de positiva blodk?…

Discussion

Laminering av det humana sklera är en metod för utförande av konfokalmikroskopi på denna vävnad. Ett kritiskt steg i denna process är användningen av etanol i stället för formalin för att fästa vävnaden. Enligt vår erfarenhet, erhålles bättre resultat vid användning av etanol i stället för formalin för fixering. Trubbiga skalp förvärra det förfarande och bör undvikas. På liknande sätt bör uttorkningen av sklera undvikas, eftersom det komplicerar proceduren och minskar kvaliteten på bilderna. <…

Materials

96% ethanol	Merck Chemicals, Darmstadt, Germany	P075.4
binocular stereo microscope	Motic, Hongkong, China	n.a
26G needles	Terumo, Leuven, Belgium	303800
15.5mm trepan	Geuder, Heidelberg, Germany	n.a
no.10 scalpel	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	2E+08
ophthalmic scalpel micro feather	Feather, pfm medical, Osaka, Japan	no. 7657BR
CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)	Dako, USA	IR610
LYVE1 antibody  (polyclonal rabbit anti human)	Zytomed, Germany	RBK014-05
goat anti mouse FITC antibody	Sigma Aldrich, Steinheim, Germany	F0257
goat anti rabbit Cy3 antibody	Dianova, Germany	111-165-003
Goat Serum normal	Dako, Glostrup, Denmark	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	6335.1
microscope slides	Engelbrecht, Edermünde, Germany	WC7695002
Coverslips 24x24mm	Th. Gayer, Lohmar, Germany	7695026
DAKO fluorescent mounting medium	DAKO, USA	S3023
LSM Meta 510 confocal microscopy	Carl Zeiss AG, Jena, Germany	n.a