İnsan sklera Konfokal Mikroskobu gerçekleştirmek için bir Laminasyon Tekniği
Summary
Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.
Abstract
sklera kapakları ve göz koruyan yoğun bağ dokusu olduğunu. Özellikle yoğun kolajen demetleri (tip I, III, IV, V, VI ve VII) oluşur. Nedeniyle otofloresansı, opaklık, ve kalınlık için, konfokal mikroskopi için uygun bulunmamıştır. Antijen alımı için doku ön ısıtma, özellikle, immünhistokimya için parafine gömüldü formalin ile fikse sklerasına kullanan teknik zorlukları vardır Burada sunulan birine alternatif bir yaklaşım. sklera hücreleri ve damarlar hem de göreceli olarak zayıf olduğu için, daha büyük doku örneklerinin kullanılması bakan hücreleri önlemek ve gemi ve diğer anatomik sitelere ilişkin kendi yerleşimini anlamada yardımcı olmak için araştırılmıştır. konfokal mikroskop altında daha büyük bir doku örneklerinin analizi için izin vermek için, bir laminasyon tekniği sklera ince tabakaları oluşturmak için gerçekleştirilmiştir. CD31 kan damarları ve lenfatik damar endotel hyalu sonuçlarının analizini takibenronan reseptör 1 (LYVE1) Bilimsel inceleme için onay elde edildiği için pozitif hücrelerin, bu yöntemin avantajları ve sınırlılıkları tartışılmıştır.
Introduction
sklera yoğun bağ dokusu yapılmış göz kapakları, sert dış tabakasıdır. Göz içi yapıları korumak için ve göz içi basıncı korumaya yardımcı olur. Böylece, sklera net görüş için gereklidir. Bu lenf damarlarının 1,2 yoksun ve böylece o ve lenfatik serbest gözün iç 3-7 arasında bir dış lenfatik serbest sınırını oluşturur. Aynı zamanda bu sayede tendonların anatomik benzerlik paylaşarak, göz dışı kaslarının için bağlanma siteleri sağlar. Sklera esas tip I kollajenin yoğun demetleri oluşur ve kolajen tip III, IV, V, VI, VIII, 8,9 ve elastin 10,11 daha az sayıda sahip olduğu için, bu doku immünohistokimya için kullanımı kolay değildir.
(1) yüzeysel vaskülarize episkleraya, konjonktiva ve tenon kapsülünün altında bulundu ve iki tarafın ve inci doğru: Anatomik olarak, sklera üç ana katmandan ayrılabiliryörüngeye bakan gözün e geri; (2) sklera stroma, sklera ana parçası; ve (3) ile doğrudan uvea üzerinde bulunan ince, pigmentli tabaka, tabakanın fusca. Sklera ile ilgili bizim anatomik bilgi 20. yüzyılın ilk yarısında kaynaklanmaktadır. O zaman, araştırmacılar başta Hindistan mürekkep enjeksiyonları 12 kullanılarak ve damar 13-15 döküm damarsal anatomisi okudu. Daha sonra, bu anjiografik çalışmalar 16-19 yılında araştırılmıştır.
O zamandan bu yana, eski teknikler geliştirildi ve yenileri bize önceki anatomik bilgiyi tamamlamak için izin olduğunu geliştirilmiştir. Bu lenfatik damar endotel spesifik hiyalüronan alıcısı-1 (LYVE1) 20 veya podoplanin 21 gibi, güvenilir lenf belirteçleri beri Örneğin, sadece on yıl olmuştur. Mikroskopisi farklı ti anatomik özelliklerini incelemek için yeni imkanlar sunuyorgöz ssues. Birden lekeler hücrelerin işaretleri ayırt etmek için ya da kan damarları ve diğer anatomik yapılara göre hücre lokalizasyonu için kullanılmak üzere bu sağlar. Numune daha büyük bir boyutta olduğunu ve ne zaman belirli bir hücre tipi arama bize örnek üzerinden tarama sağlar zaman bir bakış sağlar. Z yığın tekniği ile, konfokal mikroskopi 100-200 um kadar örnekler için kullanılabilir. Sklera kas eklemeleri arkasında 0.3 mm ve arka kutupta 11 1 mm arasındaki kalınlıklarda farklıdır. kalınlığı ve opaklık hem nedeniyle, sklera geleneksel yöntemlerle konfokal mikroskopi için uygun değildir.
Bu durumu düzeltmek için, skleral dokular konfokal mikroskobu ile analiz için izin lamine edilmiştir. Bu teknoloji, insan sklera hem de fizyolojik ve patolojik durumların daha iyi anlamaya için yararlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan sklera Laminasyon Bu doku üzerinde eş odaklı mikroskopi gerçekleştirmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu süreçte kritik bir adım doku yapıştırılması için etanol kullanımı yerine formalin olduğunu. sabitleme için etanol yerine formalin kullanırken bizim deneyim, daha iyi sonuçlar elde edilmektedir. Blunt neşter prosedürü ağırlaştırmak ve kaçınılmalıdır. Benzer şekilde, sklera kuruması o prosedürü komplike ve görüntülerin kalitesini azaltır, kaçınılmalıdır.
<p cl…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
German Research Foundation (FOR2240 “(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye” to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 “Joining Forces to Corneal Regeneration” (to CC).
Materials
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24x24mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a | |
References
- Schlereth, S. L., et al. Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).
- Schlereth, S. L., et al. Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera. Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).
- Hos, D., Cursiefen, C. Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).
- Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- Streilein, J. W. Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments. Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).
- Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen. J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).
- Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts. Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).
- Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. Characterization of collagen from normal human sclera. Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).
- Lee, R. E., Davison, P. F. Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit. Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).
- Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).
- Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. . The sclera. , (2012).
- Kiss, F. Der Blutkreislauf des Auges. Ophthalmologica. 106, 225 (1943).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).
- Ashton, N., Smith, R. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm’s canal. Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).
- Ashton, N. Anatomical study of Schlemm’s canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins. Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).
- Hayreh, S. S., Scott, W. E. Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti. Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).
- Virdi, P. S., Hayreh, S. S. Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study. Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).
- Bron, A. J., Easty, D. L. Fluorescein angiography of the globe and anterior segment. Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).
- Ikegami, M. Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author’s transl). Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
