The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.
Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.
As plantas são amplamente utilizados para produzir produtos alimentares, tais como sucos de frutas, mas eles também podem ser desenvolvidos como plataformas para a fabricação de maior valor produtos biofarmacêuticos 1-3. Em ambos os casos, o processamento a jusante (DSP) geralmente começa com a extracção de líquidos a partir de tecidos, tais como folhas ou frutos, seguida pela clarificação dos extractos de partículas carregadas de 4,5. Para a fabricação de produtos biofarmacêuticos, os custos de DSP podem ser responsáveis por até 80% dos custos globais de produção 6,7 e isso em parte reflete a alta de partículas carga presente em extratos preparados por métodos perturbadores, como a homogeneização baseada em lâmina 8,9 . Embora a selecção racional de camadas de filtro para igualar a distribuição de tamanho de partícula no extracto pode aumentar a capacidade do filtro e reduzir os custos de 10,11, a melhoria nunca poderá exceder o limite máximo da capacidade absoluta definida pelo número de partículas que deve ser retida porunidade de área de filtro para obter esclarecimentos.
O limite pode ser levantada, se menos partículas alcançam a superfície dos filtros mais finos no trem de filtração, e isto pode ser conseguido se partículas dispersas são misturados com polímeros conhecidos como floculantes que promovem agregação para formar flocos grandes 12. Tais flocos pode ser retido mais a montante pelos filtros grossos e menos caros saco, reduzindo a carga de partículas de alcançar o mais finos e filtros de profundidade mais caros. Os polímeros devem ter perfis de segurança adequadas para as suas aplicações, por exemplo, para biofármacos eles devem estar em conformidade com as boas práticas de fabricação (BPF), e, normalmente, eles devem ter uma massa molar> 100 kDa e pode ser neutro ou carregado 13. Considerando floculantes neutros actuam geralmente através de ligação cruzada partículas dispersas causando a sua agregação e a formação de flocos com diâmetros> 1mm 11, polímeros carregados neutralizar a carga de dispersed partículas, reduzindo a sua solubilidade e assim causando a precipitação 14.
A f loculação pode ser melhorado ajustando os parâmetros tais como pH ou a condutividade, e o tipo de polímero ou concentração, para combinar as propriedades do extracto 15,16. Para extractos de tabaco pré-tratados com 0,5-5,0 g L-1 de polietilenimina (PEI), um aumento superior a duas vezes na capacidade do filtro de profundidade foi relatado num processo à escala piloto 100-G. O custo deste polímero é inferior a € 10 kg -1 pelo que a sua introdução no processo resultou em economia de custos de cerca de € 6.000 para filtros e consumíveis por lote de 16 ou ainda mais quando combinado com ajudas filtração de base celulósica 17. Mesmo assim, modelos preditivos são necessários para avaliar os benefícios económicos a priori de floculantes porque a sua inclusão pode exigir etapas de espera de 15-30 min 16,18, resultando em mais custos de investimento para o armazenamentotanques. No entanto, não existem actualmente modelos mecanicistas disponíveis que podem prever o resultado de tais experiências, devido à natureza complexa de floculação. Portanto, uma abordagem de concepção de experiências-mais adequadas (DOE) 19 foi desenvolvido como descrito neste artigo. Um protocolo para o procedimento geral DoE foi recentemente publicada 20.
Dispositivos de pequena escala estão agora disponíveis para o rastreio de alto rendimento de condições de floculação 21. No entanto, estes dispositivos podem não realista simular as condições durante a floculação de extractos de plantas, porque as dimensões do vaso de reacção (~ 7 mm para os poços de uma placa de 96 poços) e as partículas ou flocos pode ser menor do que uma ordem de magnitude de intervalo. Isso pode afetar misturar padrões e, portanto, o poder preditivo do modelo. Além disso, pode ser difícil de reduzir os processos que envolvem precipitação devido às mudanças não lineares no comportamento de mistura e STA precipitadodade 22. Portanto, este artigo descreve um sistema de triagem-top-escala de bancada com um rendimento de 50-75 amostras por dia, produzindo resultados que são escaláveis do volume de reacção de 20 ml inicial para um processo em escala piloto 100 L 16. Quando combinado com uma abordagem DoE, isso permite que os modelos de previsão a ser usado para otimização de processos e documentação como parte de um conceito de qualidade-by-design.
O método descrito abaixo também pode ser adaptado para biofármacos produzidos em processos baseados em cultura de células, onde floculantes também estão sendo considerados como uma ferramenta de redução de custos 23. Ele também pode ser usado para modelar a precipitação de proteínas-alvo a partir de um extracto bruto, como parte de uma estratégia de purificação, como foi demonstrado para β-glucuronidase produzidas em canola, milho e soja 24,25. Uma descrição detalhada das propriedades floculantes podem ser encontrados em outros lugares 16,26 e é importante para assegurar que o polímero concentrções são ou não-tóxico ou abaixo dos níveis prejudiciais no produto final 11.
O aspecto mais importante a considerar ao configurar um DoE para caracterizar a floculação de partículas é que o projeto deve, em princípio, ser capaz de detectar e descrever os efeitos esperados ou possíveis 36,38, por exemplo, a influência do pH, tipo de polímero e concentração de polímero 16. Portanto, é importante para avaliar a fracção do espaço de concepção (FDS) antes de iniciar as experiências reais. O FDS é a fracção do espaço experimental multidimensional (c…
The authors have nothing to disclose.
I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ”Future-Pharma”, proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.
2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
Centrifuge tube 15 mL | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |