إجراءات لتقييم كفاءة المرسب لإزالة فرقت الجسيمات من المستخلصات النباتية
Summary
The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.
Abstract
Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.
Introduction
وتستخدم النباتات على نطاق واسع لإنتاج السلع الغذائية مثل عصائر الفاكهة، ولكن يمكن أيضا أن تكون وضعت كمنصات لتصنيع أعلى قيمة المنتجات الصيدلانية البيولوجية 1-3. في كلتا الحالتين، التجهيز النهائي (DSP) غالبا ما يبدأ استخراج السوائل من الأنسجة مثل الأوراق أو الثمار، يليه توضيح مقتطفات الجسيمات لادن 4،5. لصناعة المستحضرات الصيدلانية البيولوجية، يمكن للتكاليف DSP حساب لمدة تصل إلى 80٪ من تكاليف الإنتاج الإجمالية 6،7 وهذا في جزء يعكس ارتفاع الجسيمات عبء الحاضر في مقتطفات من الأساليب التخريبية مثل القائم على شفرة التجانس 8،9 أعدت . على الرغم من أن اختيار الرشيدة للطبقات مرشح لتتناسب مع توزيع حجم الجسيمات في استخراج يمكن أن تزيد من قدرة المرشح وخفض التكاليف 10،11، وتحسين لا يمكن أبدا أن يتجاوز سقف القدرة المطلقة التي حددها عدد من الجزيئات التي يجب أن يتم الاحتفاظ فيوحدة من ناحية التصفية لتحقيق التوضيح.
السقف يمكن رفعها إذا أقل الجسيمات تصل إلى السطح من خيرة المرشحات في القطار الترشيح، وهذا لا يمكن أن يتحقق إذا جزيئات فرقت مختلطة مع البوليمرات المعروفة باسم المرسب التي تعزز تجميع لتشكيل flocs كبيرة 12. هذه flocs يمكن الاحتفاظ مزيد من المنبع من خشونة وأقل تكلفة المرشحات الكيسية، والحد من عبء جسيم الوصول إلى أدق والمرشحات عمق أكثر تكلفة. يجب أن يكون البوليمرات لمحات سلامة مناسبة لطلباتهم، على سبيل المثال لالمستحضرات الصيدلانية البيولوجية يجب أن تكون متوافقة مع الممارسات التصنيعية الجيدة (GMP)، وعادة يجب أن لديهم المولي كتلة> 100 كيلو دالتون وإما أن تكون محايدة أو اتهام 13. في حين المرسب محايدة تعمل عموما عبر ربط جزيئات فرقت مما تسبب في تجميع وتشكيل flocs بأقطار> 1 مم 11، والبوليمرات اتهم تحييد تهمة دالجسيمات ispersed، الحد من الذوبان، وبالتالي تسبب هطول الأمطار 14.
التلبد يمكن تحسينها من خلال تعديل معايير مثل درجة الحموضة عازلة أو الموصلية، ونوع البوليمر أو الاعتقال، لتتناسب مع خصائص استخراج 15،16. لمقتطفات التبغ سابقة التجهيز مع 0،5-5،0 ز L -1 polyethylenimine (PEI)، أي بزيادة قدرها أكثر من 2 أضعاف في قدرة مرشح عمق أفيد في عملية على نطاق تجريبي 100-L. تكلفة هذا البوليمر هو -1 ذلك عرضه في عملية أسفرت أقل من € 10 كجم وفورات في التكاليف من حوالي 6000 € للمرشحات والمواد الاستهلاكية لكل دفعة 16 أو أكثر عندما جنبا إلى جنب مع القائم على السليلوز فلتر المساعدات 17. وحتى مع ذلك، يطلب من نماذج تنبؤية لتقييم مسبق الفوائد الاقتصادية من المرسب لإدراجها يمكن أن تتطلب خطوات عقد من 15-30 دقيقة 16،18، مما أدى إلى مزيد من التكاليف الاستثمارية للتخزينالدبابات. ومع ذلك، هناك حاليا أي نماذج الآلية المتاحة التي يمكن التنبؤ بنتيجة مثل هذه التجارب بسبب الطبيعة المعقدة للالتلبد. لذلك، تم تطوير أسلوب التصميم من بين التجارب أكثر ملاءمة (وزارة الطاقة) 19 كما هو موضح في هذه المقالة. وقد تم مؤخرا نشر بروتوكول لإجراء زارة الطاقة عام 20.
أجهزة صغيرة الحجم متوفرة لفحص عالية الإنتاجية من الظروف التلبد 21 الآن. ومع ذلك، فإن هذه الأجهزة قد لا محاكاة واقعية الظروف خلال التلبد من المستخلصات النباتية لأبعاد وعاء التفاعل (~ 7 ملم للآبار على لوحة 96-جيدا) والجزيئات أو flocs يمكن أن يكون أقل من أمر من حجم على حدة. هذا يمكن أن يؤثر خلط أنماط وبالتالي القدرة التنبؤية للنموذج. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن يكون من الصعب تقليص العمليات التي تنطوي على هطول الأمطار بسبب التغيرات غير الخطية في سلوك خلط وستا راسببيليتي 22. ولذلك، توضح هذه المقالة نظام فحص مقعد بين كبار النطاق مع الإنتاجية من 50-75 عينة في اليوم، مما أسفر عن النتائج التي هي قابلة للتطوير من 20 مل حجم رد الفعل الأولي ل100 L عملية على نطاق تجريبي (16). عندما جنبا إلى جنب مع نهج وزارة الطاقة، وهذا يسمح للالنماذج التنبؤية لاستخدامها في عملية التحسين وثائق كجزء من مفهوم الجودة من قبل التصميم.
ويمكن أيضا أن تتكيف الطريقة الموضحة أدناه لالمستحضرات الصيدلانية البيولوجية التي تنتج في العمليات القائمة على الثقافة الخلية، حيث يتم أيضا يجري النظر المرسب كأداة لتوفير التكاليف 23. ويمكن أن تستخدم أيضا لنمذجة الأمطار من البروتينات الهدف من استخراج النفط الخام كجزء من استراتيجية التطهير، كما هو موضح لبيتا غلوكورونيداز المنتجة في الكانولا والذرة وفول الصويا 24،25. وصف مفصل لخصائص flocculant يمكن العثور على مكان آخر 16،26 ومن المهم للتأكد من أن concentr البوليمربالجمع هي إما غير سامة أو أقل من المستويات الضارة في المنتج النهائي (11).
Protocol
Representative Results
Discussion
الجانب الأكثر أهمية في الاعتبار عند إنشاء وزارة الطاقة لتحديد خصائص الجسيمات التلبد هو أن التصميم يجب من حيث المبدأ أن تكون قادرة على كشف وبيان الآثار المتوقعة أو المحتملة 36،38، على سبيل المثال تأثير درجة الحموضة، نوع البوليمر وتركيز البوليمر 16. وبا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ”Future-Pharma”, proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.
Materials
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 mL | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
| Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
References
- Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
- Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
- Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
- De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
- Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
- Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
- Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
- Montgomery, D. C. . Design and Analysis of Experiments. , (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
- Rathore, A. S., Sofer, G. . Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , (2012).
- Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
- Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
- Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
- Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
- Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5’UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. . DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, (2000).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. . Response Surface Methods Simplified. , (2005).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. . Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , (2009).
