Procedure Om de efficiëntie van Flocculanten Evalueer voor de opheffing van de gedispergeerde deeltjes van plantenextracten

Summary

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Abstract

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

Introduction

Planten worden wijd gebruikt om levensmiddelen zoals vruchtensappen produceren, maar kunnen ook worden ontwikkeld als platforms voor de vervaardiging van hogere waarde biofarmaceutische producten ^1-3. In beide gevallen, downstream processing (DSP) begint vaak met het verwijderen van vloeistoffen uit weefsels zoals bladeren en vruchten, gevolgd door de verduidelijking van deeltjes beladen extracten ^4,5. Voor de vervaardiging van geneesmiddelen, kunnen de kosten van DSP oplopen tot 80% van de totale productiekosten ^6,7 en dit gedeeltelijk weerspiegelt de hoge belasting deeltjes aanwezig in extracten bereid met werkwijzen zoals verstorende-blade gebaseerde homogenisering ^8,9 . Hoewel de rationele selectie filterlagen de deeltjesgrootteverdeling overeen in het extract kan filtercapaciteit en lagere kosten ^10,11, kan de verbetering niet meer dan een maximum van bepaald door het aantal deeltjes dat per behouden moeten blijven absolute capaciteit-eenheid van het filter gebied om opheldering te bereiken.

Het plafond kan worden opgeheven indien minder deeltjes het oppervlak van de beste filters in de filtratietrein bereiken en dit kan worden bereikt als gedispergeerde deeltjes zijn gemengd met polymeren bekend als vlokmiddelen die aggregatie bevorderen grote vlokken ¹² vormen. Dergelijke vlokken kunnen verder stroomopwaarts van grovere en goedkoper zakkenfilters worden gehandhaafd, waardoor de deeltjes belasting bereiken hoe fijner en duurder dieptefilters. De polymeren moeten veiligheid profielen die geschikt zijn voor hun applicaties, bijvoorbeeld voor biofarmaceutische producten ze moeten voldoen aan Good Manufacturing Practice (GMP) te hebben, en meestal moeten ze een molmassa> 100 kDa hebben en kan zowel neutraal of geladen ^13. Overwegende neutrale flocculatoren het algemeen werken door het verknopen van verspreide deeltjes waardoor hun aggregatie en de vorming van vlokken met een diameter> 1 mm ^11, geladen polymeren neutraliseren van de lading van dispersed deeltjes, waardoor hun oplosbaarheid en derhalve precipitatie ¹⁴ veroorzaakt.

Flocculatie kan worden verbeterd door het instellen van parameters zoals pH of geleidbaarheid, en het polymeer type of concentratie op de eigenschappen van het extract ^15,16 passen. Tabak extracten voorbehandeld met 0,5-5,0 g L ^-1 polyethyleenimine (PEI), een meer dan 2-voudige toename dieptefilter capaciteit werd gerapporteerd in een 100-L proefschaal proces. De kosten van dit polymeer is minder dan € 10 kg ^-1, zodat de invoering ervan in het proces heeft geleid tot een kostenbesparing van ongeveer € 6.000 voor filters en verbruiksmaterialen per batch ¹⁶ of zelfs meer in combinatie met cellulose gebaseerde filter aids ^17. Toch zijn voorspellende modellen nodig om de a priori economische voordelen van flocculanten evalueren, omdat hun opname greep stappen van 15-30 min ^16,18 kan eisen, wat resulteert in verdere investeringen kosten voor opslagtanks. Echter, er zijn geen mechanistische modellen beschikbaar die de uitkomst van dergelijke experimenten kunnen voorspellen als gevolg van de complexe aard van flocculatie. Daarom is een meer passend ontwerp-of-experimenten (DoE) benadering ¹⁹ werd ontwikkeld zoals beschreven in dit artikel. Een protocol voor de algemene DoE procedure is onlangs verschenen ^20.

Kleinschalig apparaten zijn nu beschikbaar voor de high-throughput screening van flocculatie omstandigheden ^21. Echter, deze apparaten niet realistisch simuleren tijdens het uitvlokken van plantenextracten vanwege de afmetingen van het reactievat (~ 7 mm voor putten op een 96-wells plaat) en de deeltjes of vlokken kleiner dan een orde van grootte van elkaar kunnen zijn. Dit kan invloed mengen patronen en aldus de voorspellende kracht van het model. Bovendien kan het moeilijk zijn om de omvang van processen waarbij precipitatie als gevolg van niet-lineaire veranderingen in de menggedrag en neerslag stabaarheid ^22. Daarom is dit artikel schetst een bench-top-scale screening systeem met een debiet van 50-75 monsters per dag, waardoor de resultaten die schaalbaar van de eerste 20 ml reactie volume op een 100 liter pilot-schaal proces ¹⁶ zijn. In combinatie met een DoE benadering, dit maakt de voorspellende modellen worden gebruikt voor procesoptimalisatie en documentatie van een kwaliteit-van-concept.

De hieronder beschreven methode kan ook worden aangepast om biofarmaceutica geproduceerd in celkweek gebaseerde processen, waarbij flocculanten ook als een kostenbesparende gereedschap ²³ overwogen. Het kan ook worden gebruikt voor het neerslaan van doeleiwitten modelleren van een ruw extract als onderdeel van een zuiveringsstrategie, zoals aangetoond voor β-glucuronidase geproduceerd in canola, maïs en sojaboon ^24,25. Een gedetailleerde beschrijving van flocculant eigenschappen kunnen elders worden gevonden ^16,26 en het is belangrijk dat het polymeer concentraties ofwel niet giftig of minder schadelijke niveaus in het eindproduct ^11.

Protocol

1. Ontwikkel een adequate experimentele strategie Identificeer de milieu- en procesparameters die relevant zijn voor de flocculatie procedure worden vastgesteld of geoptimaliseerd, dat wil zeggen welke factoren de sterkste invloed op de flocculatie. Doorgaans zijn er meerdere van dergelijke parameters zodat een DOE benadering zoals recent beschreven 20 noodzakelijk is door het ontbreken van mechanistische modellen. Select parameters (factoren) op basis van gegevens uit de literatu…

Representative Results

Flocculatie tabak extract met verschillende polymeren De hierboven beschreven werkwijze werd met succes toegepast op een werkwijze voor het uitvlokken van tabak extracten ontwikkelen tijdens de bereiding van een monoklonaal antilichaam (het HIV-neutraliserend antilichaam 2G12) en een fluorescent eiwit (DsRed) (figuur 1) 16, en is sindsdien overgebracht andere eiwitten zoals lectinen, malaria vaccin …

Discussion

Het belangrijkste aspect om te overwegen bij het ​​opzetten van een hinde naar deeltje flocculatie karakteriseren is dat het ontwerp moet in principe in staat zijn om de verwachte of mogelijke effecten ^36,38, bijvoorbeeld de invloed van de pH, het type polymeer en polymeerconcentratie ¹⁶ detecteren en te beschrijven. Daarom is het belangrijk om de fractie van ontwerpruimte (FDS) evalueren voordat het eigenlijke experimenten. De FDS is de fractie van de multidimensionale experimentele r…

Materials

2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR device
BP-410	Furh	2632410001	Bag filter
Catiofast VSH	BASF	79002360	Flocculating agent
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Centrifuge tube 15 mL	Labomedic	2017106	Reaction tube
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chitosan	Carl Roth GmbH	5375.1	Flocculating agent
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	102446	Rockwool block
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
K700P 60D	Pall	5302305	Depth filter layer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Polymin P	BASF	79002360	Flocculating agent
POLYTRON PT 6100 D	Kinematica	11010110	Homogenization device with custom blade tool
Protein A	Life technologies	10-1006	Antibody binding protein
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS particle size distribution measurement