प्रक्रिया पौधों के अर्क से बिखरे कणों को हटाने के लिए flocculants की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए
Summary
The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.
Abstract
Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.
Introduction
पौधों को व्यापक रूप से इस तरह के फलों के रस के रूप में खाद्य वस्तुओं का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, लेकिन वे भी उच्च मूल्य biopharmaceutical उत्पादों के निर्माण के लिए 1-3 प्लेटफॉर्म के रूप में विकसित किया जा सकता है। दोनों ही मामलों में, नीचे की ओर प्रोसेसिंग (डीएसपी) अक्सर इस तरह के पत्ते या फल के रूप में ऊतकों से तरल पदार्थ की निकासी, कण-लादेन के अर्क 4,5 के स्पष्टीकरण के द्वारा पीछा के साथ शुरू होता है। बायोफार्मास्यूटिकल्स के निर्माण के लिए, डीएसपी की लागत कुल उत्पादन लागत 6.7 के ऊपर से 80% के लिए खाते सकता है और हिस्से में इस तरह के ब्लेड आधारित homogenization 8,9 के रूप में विघटनकारी तरीकों से तैयार अर्क में उच्च कण बोझ वर्तमान दर्शाता है । हालांकि फिल्टर परतों के तर्कसंगत चयन निकालने में कण आकार के वितरण के मैच के लिए फिल्टर क्षमता में वृद्धि और लागत 10,11 कम कर सकते हैं, सुधार के कणों की संख्या प्रति बनाए रखा जाना चाहिए द्वारा परिभाषित पूर्ण क्षमता की सीमा से अधिक कभी नहीं कर सकतेफ़िल्टर क्षेत्र की इकाई स्पष्टीकरण प्राप्त करने के लिए।
यदि कम कणों निस्पंदन ट्रेन में बेहतरीन फिल्टर की सतह तक पहुंचने छत उठाया जा सकता है, और अगर छितरी कणों flocculants कि एकत्रीकरण को बढ़ावा देने के लिए बड़े flocs 12 के लिए फार्म के रूप में जाना पॉलिमर के साथ मिश्रित कर रहे हैं इस हासिल की जा सकती है। इस तरह के flocs मोटे और कम खर्चीला बैग फिल्टर से आगे नदी के ऊपर बनाए रखा जा सकता है, कण बोझ महीन और अधिक महंगा गहराई फिल्टर तक पहुंचने को कम करने। पॉलिमर अपने आवेदन पत्र, बायोफार्मास्यूटिकल्स वे अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (जीएमपी) के अनुरूप होना चाहिए के लिए जैसे के लिए उपयुक्त सुरक्षा प्रोफाइल है चाहिए, और आम तौर पर वे एक दाढ़ जन> 100 केडीए होनी चाहिए और या तो तटस्थ हो या 13 का आरोप लगाया जा सकता है। जबकि तटस्थ flocculants आम तौर पर छितरी हुई कणों पार से जोड़ने की उनकी एकत्रीकरण और व्यास के साथ flocs के गठन के कारण से कार्य> 1 मिमी 11, आरोप लगाया पॉलिमर डी के प्रभारी बेअसरispersed कणों, उनके घुलनशीलता को कम करने और इस प्रकार वर्षा 14 कारण।
Flocculation ऐसे बफर पीएच या चालकता, और बहुलक प्रकार या एकाग्रता के रूप में मानकों को एडजस्ट करने, निकालने 15,16 के गुणों से मेल करने से सुधार किया जा सकता है। 0.5-5.0 जी एल -1 पॉलीएथिलएमीन (पी) के साथ pretreated तंबाकू अर्क, गहराई फिल्टर क्षमता में एक से अधिक 2 गुना वृद्धि के लिए एक 100-एल पायलट पैमाने प्रक्रिया में बताया गया था। इस बहुलक की लागत कम से कम € 10 किलो तो इस प्रक्रिया में इसकी शुरूआत बैच 16 प्रति फिल्टर और उपभोग्य सामग्रियों के लिए € के बारे में 6000 की लागत बचत में हुई -1 या और भी अधिक जब सेल्यूलोज आधारित एड्स फ़िल्टर 17 के साथ संयुक्त है। फिर भी, भविष्य कहनेवाला मॉडल भंडारण के लिए आगे निवेश लागत में जिसके परिणामस्वरूप, क्योंकि उनके शामिल किए जाने के 15-30 मिनट 16,18 की पकड़ चरणों की आवश्यकता कर सकते हैं flocculants के एक प्राथमिकताओं आर्थिक लाभ का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक हैंटैंक। हालांकि, वर्तमान में कोई यंत्रवत उपलब्ध मॉडल है कि flocculation की जटिल प्रकृति की वजह से इस तरह के प्रयोगों के परिणाम की भविष्यवाणी कर सकते हैं। इसलिए, एक अधिक उपयुक्त डिजाइन के-प्रयोगों (डीओई) दृष्टिकोण 19 इस आलेख में वर्णित के रूप में विकसित किया गया था। सामान्य डो प्रक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल हाल ही में प्रकाशित किया गया है 20।
छोटे पैमाने पर उपकरणों अब flocculation शर्तों 21 के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए उपलब्ध हैं। हालांकि, इन उपकरणों के वास्तविक संयंत्र की flocculation दौरान शर्तों अनुकरण नहीं कर सकता है निकालता है क्योंकि प्रतिक्रिया पोत (~ एक 96 अच्छी तरह से थाली पर कुओं के लिए 7 मिमी) और कणों या flocs के आयामों के अलावा परिमाण के एक आदेश से भी कम हो सकता है। इस मिश्रण पैटर्न है और इस तरह के मॉडल की भविष्यवाणी करने की शक्ति को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, यह नीचे मिश्रण व्यवहार और वेग स्टेशन में गैर रेखीय परिवर्तन के कारण वर्षा से जुड़े प्रक्रियाओं पैमाने पर करने के लिए मुश्किल हो सकता हैसाख 22। इसलिए, इस आलेख प्रति दिन 50-75 नमूनों की एक throughput के साथ एक बेंच शीर्ष पैमाने पर स्क्रीनिंग प्रणाली की रूपरेखा, परिणाम है कि एक 100 एल पायलट पैमाने प्रक्रिया 16 के लिए प्रारंभिक 20 मिलीलीटर प्रतिक्रिया मात्रा से स्केलेबल हैं उपज। जब एक हरिणी दृष्टिकोण के साथ संयुक्त, इस भविष्य कहनेवाला मॉडल एक गुणवत्ता द्वारा डिजाइन अवधारणा के हिस्से के रूप में इस प्रक्रिया के अनुकूलन और प्रलेखन के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है।
नीचे वर्णित विधि भी सेल संस्कृति आधारित प्रक्रियाओं, जहां flocculants भी एक लागत बचत उपकरण 23 के रूप में माना जा रहा है में उत्पादित बायोफार्मास्यूटिकल्स लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह भी रूप में β-glucuronidase कनोला, मक्का और सोयाबीन 24,25 में उत्पादन के लिए प्रदर्शन एक शुद्धि की रणनीति के हिस्से के रूप में एक कच्चे तेल निकालने से लक्ष्य प्रोटीन की वर्षा मॉडल का उपयोग किया जा सकता है। Flocculant संपत्तियों की एक विस्तृत वर्णन कहीं और पाया जा सकता है 16,26 और यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि बहुलक concentrations या तो गैर विषैले या अंतिम उत्पाद 11 में हानिकारक स्तर से नीचे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सबसे महत्वपूर्ण पहलू पर विचार करने के लिए जब एक हरिणी की स्थापना के कण flocculation को चिह्नित करने के लिए है कि डिजाइन सिद्धांत रूप में पता लगाने और प्रत्याशित या संभावित प्रभावों 36,38, जैसे पीएच, बहुलक प?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ”Future-Pharma”, proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.
Materials
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 mL | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
| Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
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