절차 식물 추출물에서 분산 된 입자의 제거를위한 응집제의 효율성을 평가하는

Summary

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Abstract

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

Introduction

식물은 널리 과일 주스와 같은 음식 상품을 생산하는 데 사용되지만, 그들은 또한 높은 값 ^1-3 바이오 제품의 제조를위한 플랫폼으로 개발 될 수있다. 두 경우에서, 다운 스트림 프로세싱 (DSP)는 종종 입자 함유 추출물 ^-4,5-의 설명 다음에 그러한 잎 나 과일 등의 조직으로부터의 액체의 추출과 함께 시작된다. 의약품의 제조를위한, DSP의 비용이 전체 제조 비용 ^-6,7-의 80 %를 차지할 수 있고, 이것은 부분적으로는 블레이드 기반 호모 ^-8,9- 같은 파괴적 방법에 의해 제조 된 추출물의 높은 입자 부담 본 반영 . 필터층의 합리적 선택은 필터의 용량을 증가시키고 비용을 ^{10,11 줄일} 수 추출물의 입도 분포를 일치하지만, 개선 당 유지되어야 입자의 수에 의해 정의 된 절대 용량의 한도를 초과 할 수 없다필터 영역의 단위는 설명을 달성했다.

더 적은 입자가 여과 트레인에서 최고의 필터의 표면에 도달하면 천장이 해제 될 수 있고, 분산 입자가 큰 플록 ^(12)를 형성하도록 응집을 촉진 응집제라고도 중합체와 혼합 된 경우이 달성 될 수있다. 이러한 응집물은 미세하고 고가 깊이 필터 도달 입자의 부담을 줄이고, 거친 저렴 백 필터에 의해 상기 상류 유지 될 수있다. 중합체는 좋은 제조 관행 (GMP)을 준수해야합니다 바이오 의약품에 대한 예 애플리케이션에 적합한 안전성 프로파일이 있어야하며 일반적으로 그들은 몰 질량> 100 kDa의가 있어야하며 중립적 또는 ^(13)를 충전 할 수 있습니다. 중성 응집제는 일반적으로 그 직경 응집 플록의 형성을 일으키는 분산 입자를 가교 결합하여 작용하는 반면 1mm ¹¹ 하전 중합체 (D)의 전하를 중화>ispersed 입자는 용해도를 감소시키고 따라서 침전 ^{14하게한다.}

응집은 추출물 ^{15, 16의} 특성과 일치하도록, 예컨대 완충액 pH 또는 전도도, 중합체 종류 나 농도 등의 파라미터를 조정함으로써 개선 될 수있다. 담배 0.5 내지 5.0 g의 L ^-1 폴리에틸렌 이민 (PEI)으로 전처리 추출물 깊이 필터 용량에서보다 2 배 증가 100 L 파일롯 스케일 공정에서보고되었다. 이 폴리머의 비용 미만 € 10kg 그렇게하는 과정에 도입 일괄 ¹⁶ 당 필터 및 소모품에 대한 € 6,000 비용 절감의 결과 또는 더 많은 경우 셀룰로오스 기반의 필터 보조기구 ^(17)와 결합 ^-1이다. 그럼에도 불구하고, 예측 모델은 포함이 15 ~ 30 분 ^{(16, 18)의} 유지 단계가 필요할 수 있기 때문에 저장을위한 추가 투자 비용의 결과로, 응집제의 사전 경제적 이익을 평가하는 데 필요한탱크. 그러나, 응집의 복잡한 특성으로 이러한 실험의 결과를 예측할 수있는 가능한 기계적인 모델은 현재 존재하지 않는다. 이 문서에 설명 된대로 따라서,보다 적절한 디자인의-실험 (미상) 접근 ^(19)는 개발되었다. 일반 교육청 절차에 대한 프로토콜은 최근 ²⁰ 게시되었습니다.

소규모 장치 해주기 응집 조건 ^(21)의 고 처리량 스크리닝 할 수있다. 반응 용기 (~ 96 웰 플레이트에 웰 7 ㎜) 및 입자 또는 플록의 크기는 간격 크기 순서보다 작을 수 있기 때문에,이 장치가 현실적으로 식물의 응집 동안 조건을 시뮬레이션 할 수는 추출한다. 이 때문에 패턴과 모델의 예측 능력을 혼합에 영향을 줄 수 있습니다. 또한,이 때문에 혼합 침전물 행동 역 비선형 변화 침전 관련된 프로세스를 확장 어렵다부 합성 ^(22). 따라서이 문서는 100 L 파일럿 규모의 공정 ^(16)에 초기 20 ㎖ 반응 볼륨에서 확장 성 결과를 산출, 하루에 50-75 샘플의 처리량 벤치 탑 규모의 스크리닝 시스템을 설명합니다. 암컷의 접근 방식과 함께 사용하면이 예측 모델은 품질별로 디자인 개념의 일환으로 공정 최적화 및 문서에 사용 할 수 있습니다.

아래 설명 된 방법은 또한 응집제 또한 비용 절감 수단 ^(23)으로 간주되는 세포 배양 기반 프로세스, 의약품 제조에 적용 할 수있다. 카놀라유, 옥수수 및 대두 ^{(24, 25)에서} 생산 된 β 글루 쿠로니다 아제에 대한 입증 된 바와 같이 또한, 정제 전략의 일환으로 조 추출물로부터 표적 단백질의 침전을 모델링하는데 사용될 수있다. 응집제 군데의 상세한 설명은 다른 ^{16,26 발견} 될 수 있으며 확인하는 것이 중요하다 중합체 CONCENTR관리 포인트는 비 독성 또는 최종 제품 ^(11)에 유해한 수준 이하 중 하나입니다.

Protocol

1. 적절한 실험 전략 개발 응집 과정이 요인 응집에 가장 강력한 효과를 가지고있는 즉, 설립 또는 최적화 될 수 있도록 관련된 환경 및 프로세스 매개 변수를 확인합니다. 일반적으로, 최근 20 인해 기계적 모델의 부족에 필요한 바와 같이 암컷 접근하도록 그러한 몇몇 파라미터들이있다. 문학 데이터 (12), 시스템에 대한 사전 지식과 경험을 바탕으로 선택 매?…

Representative Results

다른 중합체와 담배 추출액 응집 상기 방법은 성공적으로 모노클로 날 항체 (에이즈 중화 항체 2G12)와 형광 단백질 (을 DsRed) (도 1) (16)의 제조시 담배 추출물 응집하는 방법을 개발하는 데 사용하고, 이후 전사 된 렉틴, 말라리아 백신 후보와 융합 단백질 (게시되지 않은 데이터)를 포함하는 다른 단백질. ?…

Discussion

가장 중요한 점은 입자의 응집을 특징 암컷을 설정할 때 디자인은 원칙적으로 예를 들면 pH가, 폴리머 계 중합체의 농도 ^(16)의 영향을 예상하거나 가능한 효과 ^{(36, 38)을} 검출하고 설명 할 수 있어야한다는 것이다 고려한다. 따라서, 실제의 실험을 시작하기 전에 설계 공간 (FDS)의 비율을 평가하는 것이 중요하다. FDS는 예 250의 혼탁도의 차이를 검출하는 공지의 변동 시…

Materials

2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR device
BP-410	Furh	2632410001	Bag filter
Catiofast VSH	BASF	79002360	Flocculating agent
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Centrifuge tube 15 mL	Labomedic	2017106	Reaction tube
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chitosan	Carl Roth GmbH	5375.1	Flocculating agent
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	102446	Rockwool block
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
K700P 60D	Pall	5302305	Depth filter layer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Polymin P	BASF	79002360	Flocculating agent
POLYTRON PT 6100 D	Kinematica	11010110	Homogenization device with custom blade tool
Protein A	Life technologies	10-1006	Antibody binding protein
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS particle size distribution measurement