Procedimento para avaliar a eficiência de floculantes para a Remoção de partículas dispersas de extractos de plantas

Summary

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Abstract

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

Introduction

As plantas são amplamente utilizados para produzir produtos alimentares, tais como sucos de frutas, mas eles também podem ser desenvolvidos como plataformas para a fabricação de maior valor produtos biofarmacêuticos ^1-3. Em ambos os casos, o processamento a jusante (DSP) geralmente começa com a extracção de líquidos a partir de tecidos, tais como folhas ou frutos, seguida pela clarificação dos extractos de partículas carregadas de ^4,5. Para a fabricação de produtos biofarmacêuticos, os custos de DSP podem ser responsáveis ​​por até 80% dos custos globais de produção ^6,7 e isso em parte reflete a alta de partículas carga presente em extratos preparados por métodos perturbadores, como a homogeneização baseada em lâmina ^8,9 . Embora a selecção racional de camadas de filtro para igualar a distribuição de tamanho de partícula no extracto pode aumentar a capacidade do filtro e reduzir os custos de ^10,11, a melhoria nunca poderá exceder o limite máximo da capacidade absoluta definida pelo número de partículas que deve ser retida porunidade de área de filtro para obter esclarecimentos.

O limite pode ser levantada, se menos partículas alcançam a superfície dos filtros mais finos no trem de filtração, e isto pode ser conseguido se partículas dispersas são misturados com polímeros conhecidos como floculantes que promovem agregação para formar flocos grandes ^12. Tais flocos pode ser retido mais a montante pelos filtros grossos e menos caros saco, reduzindo a carga de partículas de alcançar o mais finos e filtros de profundidade mais caros. Os polímeros devem ter perfis de segurança adequadas para as suas aplicações, por exemplo, para biofármacos eles devem estar em conformidade com as boas práticas de fabricação (BPF), e, normalmente, eles devem ter uma massa molar> 100 kDa e pode ser neutro ou carregado ^13. Considerando floculantes neutros actuam geralmente através de ligação cruzada partículas dispersas causando a sua agregação e a formação de flocos com diâmetros> 1mm ^11, polímeros carregados neutralizar a carga de dispersed partículas, reduzindo a sua solubilidade e assim causando a precipitação ^14.

A f loculação pode ser melhorado ajustando os parâmetros tais como pH ou a condutividade, e o tipo de polímero ou concentração, para combinar as propriedades do extracto ^15,16. Para extractos de tabaco pré-tratados com 0,5-5,0 g ^L-1 de polietilenimina (PEI), um aumento superior a duas vezes na capacidade do filtro de profundidade foi relatado num processo à escala piloto 100-G. O custo deste polímero é inferior a € 10 kg ^-1 pelo que a sua introdução no processo resultou em economia de custos de cerca de € 6.000 para filtros e consumíveis por lote ^{de 16} ou ainda mais quando combinado com ajudas filtração de base celulósica ^17. Mesmo assim, modelos preditivos são necessários para avaliar os benefícios económicos a priori de floculantes porque a sua inclusão pode exigir etapas de espera de 15-30 min ^16,18, resultando em mais custos de investimento para o armazenamentotanques. No entanto, não existem actualmente modelos mecanicistas disponíveis que podem prever o resultado de tais experiências, devido à natureza complexa de floculação. Portanto, uma abordagem de concepção de experiências-mais adequadas (DOE) ¹⁹ foi desenvolvido como descrito neste artigo. Um protocolo para o procedimento geral DoE foi recentemente publicada ^20.

Dispositivos de pequena escala estão agora disponíveis para o rastreio de alto rendimento de condições de floculação ^21. No entanto, estes dispositivos podem não realista simular as condições durante a floculação de extractos de plantas, porque as dimensões do vaso de reacção (~ 7 mm para os poços de uma placa de 96 poços) e as partículas ou flocos pode ser menor do que uma ordem de magnitude de intervalo. Isso pode afetar misturar padrões e, portanto, o poder preditivo do modelo. Além disso, pode ser difícil de reduzir os processos que envolvem precipitação devido às mudanças não lineares no comportamento de mistura e STA precipitadodade ^22. Portanto, este artigo descreve um sistema de triagem-top-escala de bancada com um rendimento de 50-75 amostras por dia, produzindo resultados que são escaláveis ​​do volume de reacção de 20 ml inicial para um processo em escala piloto 100 L ^16. Quando combinado com uma abordagem DoE, isso permite que os modelos de previsão a ser usado para otimização de processos e documentação como parte de um conceito de qualidade-by-design.

O método descrito abaixo também pode ser adaptado para biofármacos produzidos em processos baseados em cultura de células, onde floculantes também estão sendo considerados como uma ferramenta de redução de custos ^23. Ele também pode ser usado para modelar a precipitação de proteínas-alvo a partir de um extracto bruto, como parte de uma estratégia de purificação, como foi demonstrado para β-glucuronidase produzidas em canola, milho e soja ^24,25. Uma descrição detalhada das propriedades floculantes podem ser encontrados em outros lugares ^16,26 e é importante para assegurar que o polímero concentrções são ou não-tóxico ou abaixo dos níveis prejudiciais no produto final ^11.

Protocol

1. Desenvolver uma estratégia experimental adequado Identificar os parâmetros ambientais e de processo que são relevantes para o processo de floculação a ser estabelecida ou otimizado, ou seja, quais os factores que têm o efeito mais forte sobre floculação. Tipicamente, existem várias de tais parâmetros para uma abordagem recentemente descrita como corça de 20 é necessária devido à falta de modelos mecanísticos. Selecione os parâmetros (fatores) com base em dados d…

Representative Results

A floculação do extracto de tabaco com diferentes polímeros O método descrito acima foi utilizado com sucesso para desenvolver um processo para a floculação de extractos de tabaco durante o fabrico de um anticorpo monoclonal (o anticorpo de HIV-neutralizante 2G12) e uma proteína fluorescente (DsRed) (Figura 1) 16, e uma vez que tenha sido transferida a outras proteínas incluindo lectinas, ca…

Discussion

O aspecto mais importante a considerar ao configurar um DoE para caracterizar a floculação de partículas é que o projeto deve, em princípio, ser capaz de detectar e descrever os efeitos esperados ou possíveis ^36,38, por exemplo, a influência do pH, tipo de polímero e concentração de polímero ^16. Portanto, é importante para avaliar a fracção do espaço de concepção (FDS) antes de iniciar as experiências reais. O FDS é a fracção do espaço experimental multidimensional (c…

Materials

2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR device
BP-410	Furh	2632410001	Bag filter
Catiofast VSH	BASF	79002360	Flocculating agent
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Centrifuge tube 15 mL	Labomedic	2017106	Reaction tube
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
Chitosan	Carl Roth GmbH	5375.1	Flocculating agent
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	102446	Rockwool block
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
K700P 60D	Pall	5302305	Depth filter layer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Polymin P	BASF	79002360	Flocculating agent
POLYTRON PT 6100 D	Kinematica	11010110	Homogenization device with custom blade tool
Protein A	Life technologies	10-1006	Antibody binding protein
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS particle size distribution measurement