Процедура оценки эффективности флокулянтов для удаления дисперсных частиц из растительных экстрактов
Summary
The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.
Abstract
Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.
Introduction
Растения широко используются для производства продовольственных товаров , таких как фруктовые соки, но они также могут быть разработаны в качестве платформы для производства более ценных продуктов биофармацевтических 1-3. В обоих случаях, вниз по течению обработки (DSP) часто начинается с извлечения жидкости из тканей , таких как листья или плоды, а затем разъяснении частиц нагруженные экстрактов 4,5. Для изготовления биофармацевтических, стоимость DSP может составлять до 80% от общих расходов 6,7 производства , и это отчасти отражает высокий частиц шихты , присутствующий в экстрактах , полученных с помощью подрывных методов , таких как лезвия на основе усреднении 8,9 , Несмотря на то, рациональный отбор фильтрующих слоев в соответствии с распределением частиц по размерам в экстракте может увеличить пропускную способность фильтра и снизить затраты 10,11, улучшение никогда не может превышать потолок абсолютной мощности , определенной по числу частиц , которые должны быть сохранены вединица площади фильтра для достижения разъяснения.
Потолок может быть поднята , если меньше частиц достигают поверхности лучших фильтров в фильтрационной поезде, и это может быть достигнуто , если диспергированные частицы смешивают с полимерами , известными в качестве флокулянтов , которые способствуют агрегации с образованием больших хлопьев 12. Такие Хлопья могут быть сохранены дальше вверх по течению от более грубых и менее дорогие фильтры мешка, уменьшая нагрузку частиц, достигающего тоньше и более дорогие глубины фильтров. Полимеры должны иметь профили безопасности , подходящие для их применения, например , для биофармацевтических они должны быть совместимы с надлежащей производственной практики (GMP), и , как правило , они должны иметь молекулярную массу> 100 кДа и может либо быть нейтральным или заряженный 13. В то время как нейтральные флокулянты в общем действуют сшивкой дисперсные частицы , что приводит к их агрегации и образование флокул диаметром> 1 мм 11, заряженные полимеры нейтрализуют заряд Dispersed частицы, уменьшая их растворимость и , таким образом , вызывая осаждение 14.
Флокуляции может быть улучшена за счет регулировки таких параметров, как буфера рН или проводимость, а также от типа полимера или концентрации, чтобы соответствовать свойствам экстракта 15,16. Что касается табачных экстрактов , предварительно обработанных с 0,5-5,0 г L -1 полиэтиленимина (PEI), большее , чем 2-кратное увеличение емкости глубинного фильтра сообщалось в процессе опытно-промышленные 100-L. Стоимость этого полимера меньше , чем € 10 кг -1 поэтому его введение в процесс привело к экономии около € 6000 для фильтров и расходных материалов на партию 16 или даже больше , когда в сочетании с целлюлозой на основе фильтрующих средств 17. Тем не менее , прогностические модели должны оценивать априорных экономические выгоды от флокулянтов , потому что их включение может потребовать шаги трюме 15-30 мин 16,18, в результате дальнейших инвестиционных затрат на хранениетанки. Тем не менее, в настоящее время нет механистические модели доступны, которые могут предсказать исход таких экспериментов из-за сложного характера флокуляции. Таким образом, подход 19 более соответствующие эксперименты дизайн-оф-(DOE) был разработан , как описано в этой статье. Протокол общей процедуре МЭ Недавно были опубликованы 20.
Небольшие устройства теперь доступны для высокопроизводительного скрининга условий флокуляции 21. Тем не менее, эти устройства не могут реально имитировать условия во время флокуляции экстрактов растений, так как размеры реакционного сосуда (~ 7 мм для лунок на 96-луночный планшет) и частиц или хлопьев может быть меньше, чем на порядок друг от друга. Это может повлиять на смешивание модели и, следовательно, предсказательная сила модели. Кроме того, это может быть трудно сократить масштабы процессов с участием осадков из-за нелинейных изменений в поведении и смешивания осадка ГНА22 ность. Поэтому в данной статье излагается стендовая масштабную систему скрининга с пропускной способностью 50-75 образцов в день, что дает результаты, которые масштабируются от исходного 20 мл реакционного объема в процессе 16 опытно-промышленные 100 л. В сочетании с подходом DOE, это позволяет прогностические модели, которые будут использоваться для оптимизации процесса и документации в рамках концепции качества по-дизайну.
Метод , описанный ниже , может также быть адаптирован к биофармацевтических , производимых в процессе культивирования клеток на основе, где флокулянт также рассматриваются в качестве инструмента 23 экономии. Он также может быть использован для моделирования осаждения белков – мишеней из неочищенного экстракта в качестве составной части стратегии очистки, как показано на бета-глюкуронидазы , полученного в канолы, кукурузы и сои 24,25. Подробное описание флокулянтов свойств можно найти в других 16,26 и важно , чтобы гарантировать , что полимер концентрations либо нетоксичный или ниже вредных уровней в конечном продукте 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Самый важный аспект необходимо учитывать при создании DoE для характеристики флокуляции частиц является то , что конструкция в принципе должна быть в состоянии обнаружить и описать предполагаемые или возможные эффекты 36,38, например , влияние рН, типа полимера и концентрации <s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ”Future-Pharma”, proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.
Materials
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 mL | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
| Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
References
- Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
- Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
- Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
- De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
- Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
- Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
- Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
- Montgomery, D. C. . Design and Analysis of Experiments. , (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
- Rathore, A. S., Sofer, G. . Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , (2012).
- Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
- Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
- Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
- Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
- Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5’UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. . DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, (2000).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. . Response Surface Methods Simplified. , (2005).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. . Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , (2009).
