Glycan Node Analyse: en bottom-up tilgang til Glycomics

Summary

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Abstract

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides (“glycan nodes”) present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

Introduction

Glycolipider, glycoproteiner, proteoglycaner og glykosaminoglycaner udgør de fire vigtigste klasser af komplekse, heterogene kulhydrater kollektivt kendt som glykaner. Som allestedsnærværende og integrerede dele af plasmamembranen, glycocalyx, og ekstracellulær matrix og væsker, glycaner deltage i så forskellige biokemiske processer som endocytose, intracellulær transport, cellemotilitet, signaltransduktion, molekylær genkendelse, receptoraktivering, celleadhæsion, værtspatogene interaktion , intercellulære kommunikation, immunosurveillance, og immunrespons indvielse. ¹ til stede i næsten alle områder af livet, enzymer kaldet glycosyltransferaser der bygger glycan polymerer handle i tandem med glycosidhydrolaser (også kendt som glykosidaser, som nedbryder glycaner) at opføre, remodel, og i sidste ende producere færdigbehandlet glycan polymerer ^2. Selv om hver glycosyltransferase kan operere på forskellige glycokonjugater, en glycosyltransferasegenerelt skabes en linkage- og anomer-specifik glycosidbinding ved at overføre monosaccharidet del af en bestemt aktiveret nukleotid sukker donor (f.eks BNP-fucose) til en bestemt kategori af nukleofile acceptorer (f.eks et lipid, polypeptid, nukleinsyre, eller dyrkning oligosaccharid). Det er blevet anslået, at mere end 50% af proteiner (især membran og sekretoriske proteiner) er posttranslationelt modificeret ved glykosylering ³ Rudimentære kombinatoriske beregninger giver en forståelse for den betydelige variation, alsidighed, og specificitet indrømmes glycoproteiner ved glykosylering.; for eksempel, hvis et polypeptid substrat har kun 10 glycosyleringssteder og hvert sted kan danne en glycosidbinding med 1 af kun 3 forskellige monosaccharid reducerende ender, så i princippet den endelige glycoprotein kan antage 3 ¹⁰ = 59.049 forskellige identiteter. I glycoproteiner, glycosidbindinger almindeligvis dannes med sidekæden nitrogen of asparaginrester i sekvensen Asn-X-Ser / Thr (X kan være enhver aminosyre bortset fra prolin), hvilket gav N -glycans ² og sidekæde-hydroxyler af serin og threoninrester til opnåelse O -glycans ^4. Sammensætningen af en celles glycome (dvs. dens supplement af glycosylering produkter) er unik og begrænset, fordi, med få undtagelser, glycosyltransferaser udviser streng donor, acceptor, og kobling specificitet. ⁵ vigtige og rigelige blodplasma glycoproteiner lider afvigende glycosylering som en downstream konsekvens for unormal glycosyltransferase ekspression og aktivitet på grund af mange patologiske tilstande, især cancer og inflammatoriske sygdomme. ^6-24

Hovedsageligt på grund af epigenetiske faktorer, den glycome er betydeligt mere forskelligartet, dynamisk og kompleks end proteom og transkriptomet. ^25,26 Mens ca. 1% af det mammale genom koder formationen, modifikations- ogsamling af glykaner, til ²⁷ glycosylerings foregår på en ikke-template-drevet måde-en markant kontrast polypeptid og nukleinsyre biosyntese. Samspillet mellem den relative mængde og aktivitet af glycosyleringsenzymer og sådanne miljømæssige faktorer som næringsstoffer og forløber tilgængelighed i sidste ende bestemmer naturen, sats, og omfanget af glycosylering. ^5,28 embryogenese (f.eks, beslutsomhed og differentiering), cellulær aktivering, og progression gennem cellecyklus indflydelse genekspression (dvs. transkription og translation) og ændre identiteten og mængden af tilgængelige glycosyltransferaser, hvis aktivitet er den umiddelbare opstrøms determinant af cellens glycan profil. Fordi (nogle af) proliferative, lim, og invasive egenskaber af kræftceller ligner almindelige embryogene celler, specifikke ændringer i glycan biosynteseveje (f.eks forløber ophobning, dereguleret udtryk, aberrant modifikation, strukturel trunkering, eller en ny formation) tjener som universelle kræft biomarkører, der indikerer forskellige stadier af tumordannelse, progression, migration og invasion ²⁹ Selv glykosylering er meget kompleks, åbenbart kun få ændringer i glykosylering kan aktivere carcinogenese og metastase.; tilsyneladende, visse "afvigende" glycosylering produkter faktisk gavne kræftceller ved at give dem mulighed for at unddrage sig immune anerkendelse og overleve de krav, migration i ugæstfrie intravaskulære og metastatiske miljøer. ^28,30,31 Ikke overraskende har eksperimenter vist, at forstyrre eller forhindre mønstre af ændret genekspression og afvigende glycan dannelse kan standse tumorigenese. ²⁹ ikke desto mindre afvigende glycaner påvist i en biovæske prøve (fx urin, spyt, og blodplasma eller serum) kan ikke være direkte indikatorer for kræft (eller anden sygdom), men snarere nedstrøms resultaterne af subtile endnu betydeligændringer i immunsystemet eller kvantificerbare forgreninger af en skadelig tilstand i et uforudsigeligt organ. ³²

Selv om de giver universel oplysninger om glycome, mange molekylære interaktion-baserede Glycomics teknikker (f.eks lektin / antistof arrays og metaboliske / kovalente mærkning) afhænger af påvisning af hele glykanstrukturer og giver ikke detaljeret strukturel information om de enkelte glykaner. I skærende kontrast, kan massespektrometri (MS) hjælpe med at identificere og kvantificere de enkelte glykanstrukturer og afslører sådanne strukturel information som bindingssteder til polypeptid kerner. Dereguleret ekspression eller aktivitet af kun én glycosyltransferase kan starte en kaskade af skadelige molekylære begivenheder i flere glycosyleringsveje. Fordi hver glycosyltransferase kan operere på mere end én glycokonjugat substrat og på tværs af forskellige voksende glycan polymerer, deregulerede biosyntetiske kaskader giver uforholdsmæssignelt øgede mængder af kun én glycan produkt men flere heterogene klasser af afvigende glycaner i intra- eller ekstracellulære væsker. ³³ Sådanne unikke afvigende glycaner betragtes undertiden upraktisk som biomarkører for kræft eller andre glycan-affektive patologier fordi sammenlignet med den store pool af velreguleret glycaner, disse afvigende glycaner udgør en meget lille fraktion, der kan ofte forblive upåviselig selv af sådanne meget følsomme teknikker som massespektrometri. For eksempel i intra- og ekstracellulære legemsvæsker, kan den brede protein-koncentration spektrum (som strækker sig otte størrelsesordener) forhindre detektering af knappe glycoproteiner, der er maskeret af de mere udbredte arter. ³² Herudover bestemmelse glycosyltransferase aktivitet er fortsat en betydelig praktisk og teoretisk udfordring, fordi mange glycosyltransferaser er fraværende i kliniske kropsvæsker eller bliver inaktive ex vivo. Trods vanskeligheden ved consistently påvisning og kvantificering ultra-små mængder af unikke hele glykaner, har udøvere af massespektrometri gjort enorme fremskridt i retning af at ansætte intakte glycaner som kliniske markører. Vi har for nylig udviklet en komplementær tilgang til analyse af intakte glycaner at ansætte GC-MS, letter påvisning af alle konstituerende gren-point og sammenkædning-specifikke monosaccharider ( "glycan knuder"), der tilsammen give unikke til hver glycan og i mange sager direkte tjene som molekylære surrogater, der kvantificerer den relative aktivitet af den skyldige glycosyltransferase (s).

Siden sin første rapporterede direkte anvendelse til glycan analyse i 1958, har gaskromatografi (GC) bevist en kraftfuld teknik til at analysere pr-methylerede mono- og disaccharider, ³⁴ bestemme deres anomericity og absolut konfiguration, og adskille dem til efterfølgende massespektrometrisk analyse. ³⁵ mellem 1984 og 2007, Ciucanu og kollegerindført og raffineret en fast-fase glycan permethylering teknik, der beskæftigede natriumhydroxid og iodmethan, efterfulgt af væske / væske ekstraktion af permethylerede glycaner ved hjælp af vand og chloroform. ^35,36 Mellem 2005 og 2008, Kang og medarbejdere integreret en tidsbesparende tur -søjle tilgang til permethylering trin. ^37,38 i 2008 Goetz forskergruppen udtænkt en kvantitativ fastfase permethylering glycan-profilering metoden ved hjælp matrix-assisteret laser desorption-ionisering (MALDI) massespektrometri til at sammenligne og potentielt skelne invasive og non -invasive brystkræftceller, ³⁹ derefter, i 2009, Goetz teamet kombineret enzymatiske og teknikker kemiske udslip at spalte O -glycans fra intakte glycoproteiner i et stærkt alkalisk fastfase permethylering ordningen ⁴⁰ Selv om Goetz procedure lettet samtidig permethylering og kemiske udslip. af O -glycans, blev det kun anvendes på forhånd isoleret glycoproteiner. Vi ændret denne teknik i 2013 og tilpasset det til hele ufraktionerede kropsvæsker og homogeniserede vævsprøver ved inkorporering trifluoreddikesyre (TFA) hydrolyse, reduktion, og acetylering trin. ³³ Disse yderligere trin også frigive glycaner fra glycolipider og N-forbundet glycaner fra glycoproteiner og konvertere dem i delvist denatureret alditolacetater (PMAAs, figur 1), hvis særprægede methylering-og-acetyleringsniveauer mønstre lettere ved GC-MS og entydigt karakterisere de indgående glycan knudepunkter i den oprindelige intakt glycan polymer ⁴¹ (figur 2). ³³ i sidste ende, dette procedure producerer en sammensat portræt af alle glycaner i en kompleks biovæske baseret på direkte, relativ kvantificering af unikke glycan funktioner som "kerne fucosylering", "6-sialylering", "halverer GlcNAc", og "beta 1-6 forgrening" – hver stammer fra en enkelt GC-MS chromatographic højdepunkt. Denne artikel præsenterer yderligere optimering af permethylering, acetylering, isolation og oprydning etaper sammen med forbedringer i den tilstand af relativ kvantificering.

Protocol

Advarsel: Undgå hud / øjenkontakt med nogen af de anvendte reagenser i dette eksperiment. Ved eksponering skylles grundigt det berørte område med vand og straks søge lægehjælp. 1. permethylering og Glycan Extraction kolonne Fremstilling Få så mange mikrofuge spinkolonne enheder som de prøver, der skal analyseres. Break og tag plast reservoir rør caps. Placer en mikrofuge mini filter i hvert reservoir rør. Placer de samlede mikrofugerør spin-søjl…

Representative Results

En komplet ionstrøm kromatogram (TIC), der viser succesfuld permethylering, hydrolyse, reduktion og acetylering af humant blodplasma prøver i forhold til tilfælde, hvor to kritiske permethylering trin blev udført forkert er vist i figur 3. Absolute Udbytte af HexNAcs forhold til hexoser: N -acetylhexosamine (HexNAc) delvist den…

Discussion

Generelt vellykket produktion af delvist methylerede alditolacetater (PMAAs) fra hexoser er fyldt med færre vanskeligheder og er mere robust end vellykket produktion af N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Den nøjagtige mekanisme bag dette fænomen, da det spiller i hvert trin i denne procedure er ukendt, men skal forholde sig til den unikke kemi af N-acetyl-gruppen (i stedet for hydroxylgruppen), der er unik for HexNAcs forhold til hexoser. Mekanismen bag dette fænomen som den vedrører syrehydrolys…

Materials

Sodium hydroxide beads	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 mL Spin column	69705	Pierce division of ThermoFisher Scientific	Includes  plugs and polyethylene frits
GC-MS autosampler vial (silanized)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific	Target DP High Recovery Vial, 1.5 mL, 12 x 32 mm, Includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 mL polypropylene test tubes	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
2 mL polypropylene test tubes	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane	I8507	Sigma-Aldrich	Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrifuge	75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)*	53283-800	VWR	13 x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride	S7653	Sigma-Aldrich	>99.5% pure
Chloroform	4440-08	Macron Fine Chemicals
Trifluoroacetic acid	299537	Sigma-Aldrich	99% purified by redistillation for protein sequencing
Sodium borohydride	71321	Fluka Analytical	99%
Ammonium hydroxide solution	320145	Sigma-Aldrich	NH3 content: 28.0 – 30.0%
Methanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Jackson	HPLC grade
Acetic acid	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
Plastic vacuum desiccator	Any model of adequate size	FoodSaver
Acetic anhydride	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
Dichloromethane	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Stabilized HPLC grade
Acetone	9006-03	J.T.Baker	Baker Analyzed
Heated evaporation manifold (main unit)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator)	pi18826	ThermoFisher Scientific	ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold	pi18816	ThermoFisher Scientific	Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13mm dia test tubes, 13 holes (14 dia. x 45mm deep)
Gas chromatograph	Model A7890	Agilent	Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer	GCT Premier (Time-of-Flight)	Waters
Split-mode liner (deactivated / silanized)	5183-4647	Agilent	Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column	122-5532	Agilent	30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane	95541	Sigma-Aldrich
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.