This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.
Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides (“glycan nodes”) present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.
السكرية، البروتينات السكرية، بروتيوغليكان، والجليكوزامينوجليكان تشكل الطبقات الأربعة الرئيسية، والكربوهيدرات المعقدة غير المتجانسة والتي تعرف باسم glycans. كمكونات في كل مكان ولا يتجزأ من غشاء البلازما، الكنان السكري، والمصفوفة خارج الخلية والسوائل، glycans مشاركة في مثل هذه العمليات الكيميائية الحيوية المتنوعة كما الإلتقام والاتجار داخل الخلايا، حركية الخلية، ونقل الإشارة، والتعرف الجزيئي، تنشيط مستقبلات، التصاق الخلايا والتفاعل المضيف الممرض ، بين الخلايا والاتصالات، والترصد المناعي، والمناعي استجابة بدء 1 الحاضر تقريبا في كل مجال من الحياة، والانزيمات المعروفة باسم glycosyltransferases أن بناء البوليمرات غليكان تعمل جنبا إلى جنب مع هيدروليز الأنتراكينون (المعروف أيضا باسم glycosidases، والذي كسر glycans) لبناء وإعادة تشكيلها، وفي نهاية المطاف تنتج الانتهاء البوليمرات غليكان 2. وعلى الرغم من كل ناقلة الغليكوزيل قد تعمل على غليكوكونجوغاتيس مختلفة، وهي ناقلة الغليكوزيلتقيم عموما linkage- ومصاوغ كربونيلي محددة رابطة غليكوسيدية عن طريق نقل شاردة أحادي السكاريد من معين النوكليوتيدات تنشيط السكر المانحة (على سبيل المثال، الناتج المحلي الإجمالي فوكوسي) على فئة معينة من يقبلون أليفة النواة (على سبيل المثال، الدهن، ببتيد، الحمض النووي، أو تزايد قليل السكاريد). وتشير التقديرات إلى أن أكثر من 50٪ من البروتينات (خاصة غشاء والبروتينات إفرازية) هي مرحلة ما بعد translationally تعديلها من قبل بالغليكوزيل 3 حسابات اندماجي البدائية تقدم تقديرا للتفاوتا كبيرا، وبراعة، وخصوصية الممنوحة للبروتينات سكرية التي كتبها بالغليكوزيل؛ على سبيل المثال، إذا كان الركيزة ببتيد لديها فقط 10 مواقع بالغليكوزيل وكل موقع يمكن أن تشكل صلة غليكوزيدية مع 1 من 3 فقط أحادي السكاريد مختلف الغايات الحد، ثم، من الناحية النظرية، وبروتين سكري النهائي يمكن أن تتحمل 3 10 = 59049 هويات متميزة. في بروتينات سكرية، والروابط غليكوزيدية تشكل عادة مع الجانب سلسلة النيتروجين سالمخلفات و الهليونين في تسلسل الأسباراجين-X-سر / منتدى المجالس الرومانسية (X يمكن أن يكون أي من الأحماض الأمينية إلا البرولين) لانتاج N -glycans 2 والجانبية سلسلة الهيدروكسيل سيرين وثريونين المخلفات لانتاج يا -glycans 4. تكوين glycome الخلية (أي مكمل من المنتجات بالغليكوزيل) هي فريدة من نوعها ومحدود، لأنه مع وجود استثناءات قليلة، glycosyltransferases يحمل المانحة الصارم، متقبل، وخصوصية الربط. 5 بروتين بلازما الدم هامة وفيرة تعاني بالغليكوزيل الشاذة نتيجة المصب التعبير ناقلة الغليكوزيل غير طبيعي والنشاط بسبب العديد من الحالات المرضية، وخاصة السرطان والأمراض الالتهابية. 6-24
ويرجع ذلك أساسا إلى عوامل جينية، وglycome بشكل ملحوظ أكثر تنوعا وديناميكية، ومعقدة من بروتيوم وTranscriptome على. 25،26 بينما ما يقرب من 1٪ من الجينوم الثدييات بترميز تشكيل وتعديل، وتجميع glycans، 27 العائدات بالغليكوزيل بطريقة تناقض ملحوظ مدفوعة غير القالب إلى ببتيد والحيوي الحمض النووي. التفاعل بين كمية النسبية ونشاط الأنزيمات بالغليكوزيل وهذه العوامل البيئية مثل توافر المواد الغذائية والسلائف يحدد في نهاية المطاف الطبيعة، ومعدل، ومدى ارتباط بالغليكوزيل. 5،28 مرحلة التطور الجنيني (على سبيل المثال، تقرير والتمايز)، وتفعيل الخلوي، وتقدم من خلال التعبير تأثير الجينات دورة الخلية (أي النسخ والترجمة) ويغير هوية وكمية من glycosyltransferases المتاحة، الذي النشاط هو المحدد المنبع الفوري لمحة غليكان الخلية. لأن (بعض) التكاثري، لاصق، وخصائص الغازية من الخلايا السرطانية تشبه الخلايا تخلقي العادية، تغييرات محددة في مسارات السكروز غليكان (على سبيل المثال، وتراكم السلائف والتعبير حررت، aberranر التعديل، اقتطاع الهيكلي، أو تشكيل رواية) تخدم المؤشرات الحيوية السرطان العالمية التي تشير إلى مراحل مختلفة من تشكيل الورم، والتقدم، والهجرة، وغزو 29 وعلى الرغم من ارتباط بالغليكوزيل معقد للغاية، ومن الواضح سوى عدد قليل من التعديلات في بالغليكوزيل أن تمكن السرطان وورم خبيث؛ على ما يبدو، بعض "الشاذة" المنتجات بالغليكوزيل تستفيد بالفعل الخلايا السرطانية من خلال تمكينهم من التهرب من الاعتراف المناعة، والبقاء على قيد الحياة لمطالب الهجرة في البيئات داخل الأوعية الدموية والمنتشر وعرة. 28،30،31 ليس من المستغرب، وقد كشفت التجارب أن تعطيل أو منع أنماط تغيير التعبير الجيني وتشكيل غليكان الشاذة يمكن أن توقف تكون الأورام. 29 ومع ذلك، فإن glycans الشاذة في الكشف عن عينة biofluid (على سبيل المثال، والبول واللعاب، وبلازما الدم أو المصل) قد لا تكون المؤشرات المباشرة من السرطان (أو مرض آخر)، ولكن المصب بدلا نتائج خفية بعد هامةتغييرات في الجهاز المناعي أو عواقب يمكن قياسها من شرط الخبيثة في الجهاز لا يمكن التنبؤ بها. 32
على الرغم من أنها تقدم معلومات شاملة عن glycome، العديد من الجزيئية تقنيات glycomics القائم على التفاعل (على سبيل المثال، كتين / صفائف الأجسام المضادة والتمثيل الغذائي / التساهمية التوسيم) تعتمد على الكشف عن هياكل غليكان كلها وليس لتوفير المعلومات الهيكلية المفصلة حول glycans الفردية. في تناقض واضح، ويمكن قياس الطيف الكتلي (MS) تساعد في تحديد وقياس هياكل غليكان الفردية وتكشف هذه المعلومات الهيكلية مثل مواقع التعلق النوى ببتيد. التعبير حررت أو نشاط ناقلة الغليكوزيل واحد فقط يمكن الشروع في سلسلة من الأحداث الجزيئية ضارة في مسارات بالغليكوزيل متعددة. لأن كل ناقلة الغليكوزيل قد تعمل على الركيزة glycoconjugate أكثر من واحد وعبر مختلف البوليمرات غليكان المتزايد، شلالات السكروز حررت تسفر disproporزيادة دوليا هو كميات من المنتج غليكان واحد فقط ولكن عدة فئات غير متجانسة من glycans الشاذة في سوائل البينية أو خارج الخلية، وتعتبر 33 بيد أن هذه glycans الشاذة الفريدة في بعض الأحيان غير عملي والمؤشرات الحيوية للسرطان أو غيره من الأمراض غليكان-الوجدانية ل، مقارنة مع حمام سباحة كبير من glycans منظمة تنظيما جيدا، وهذه glycans الشاذة تمثل جزء صغير جدا التي قد تبقى في كثير من الأحيان لا يمكن الكشف عنها حتى من قبل هذه التقنيات حساسة للغاية كما مطياف الكتلة. على سبيل المثال، في سوائل الجسم البينية وخارج الخلية، وطيف واسع تركيز البروتين (الذي يمتد ثمانية أوامر من حجم) يمكن أن يمنع الكشف عن بروتينات سكرية النادرة التي يتم من قبل ملثمين الأنواع أكثر وفرة. 32 وعلاوة على ذلك، وتحديد النشاط ناقلة الغليكوزيل لا تزال كبيرة عملي والتحدي النظري لأن العديد من glycosyltransferases غائبة في biofluids السريرية أو تصبح غير نشطة خارج الحي. وعلى الرغم من صعوبة consistenكشف TLY وقياس كميات دقيقة جدا من glycans كاملة فريدة من نوعها، جعلت ممارسي قياس الطيف الكتلي خطوات هائلة نحو توظيف glycans سليمة كعلامات السريرية. لقد وضعت مؤخرا اتباع نهج متكامل لتحليل glycans سليمة أن توظف GC-MS، يسهل الكشف عن جميع المكونة فرع نقطة والسكريات الأحادية-الربط معين ( "العقد غليكان") التي نقلها معا تفرد لكل غليكان وفي كثير الحالات تكون مباشرة بدائل كما الجزيئية التي قياس النشاط النسبي للناقلة الغليكوزيل تحت طائلة المسؤولية (ق).
منذ لأول ذكرت التطبيق المباشر لتحليل غليكان في عام 1958، وقد ثبت اللوني للغاز (GC) تقنية قوية لتحليل ميثليته لكل أحادية و disaccharides، 34 تحديد anomericity والتكوين المطلق، وفصلها عن التحليل الطيفي الشامل لاحق. 35 بين عامي 1984 و 2007، Ciucanu والزملاءقدم والمكرر الصلبة مرحلة permethylation غليكان التقنية التي تستخدم هيدروكسيد الصوديوم وiodomethane، تليها استخراج السائل / السائلة من glycans permethylated باستخدام الماء والكلوروفورم. 35،36 بين عامي 2005 و 2008، كانغ وزملاء العمل المتكاملة تدور لتوفير الوقت نهج -column في خطوة permethylation. 37،38 في عام 2008، ابتكرت مجموعة بحث جويتز على كمية الصلبة مرحلة permethylation طريقة غليكان-التنميط باستخدام مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين (MALDI) قياس الطيف الكتلي للمقارنة والتمييز الغازية وغير محتملة -invasive خلايا سرطان الثدي (39)؛ ثم، في عام 2009، وفريق جويتز جنبا إلى جنب الأنزيمية وتقنيات الافراج الكيميائية ليلتصق يا -glycans من بروتينات سكرية سليمة في مخطط permethylation الصلبة مرحلة شديدة القلوية 40 على الرغم من أن الإجراء جويتز تسهيل permethylation في وقت واحد، والإفراج الكيميائية. من يا -glycans، تم تطبيقه فقط إلى ما قبل معزولة غليكوالبروتينات. نحن تعديل هذه التقنية في عام 2013 وتكييفه لbiofluids غير المجزأ كاملة وعينات الأنسجة المتجانس من خلال دمج حمض trifluoroacetic (TFA) التحلل، والحد، وأستلة الخطوات. 33 وهذه خطوات إضافية أيضا إطلاق سراح glycans من السكرية وN -linked glycans من بروتينات سكرية وتحويل لهم في الأسيتات مميثل جزئيا alditol (PMAAs، الشكل 1)، الذي مميزة أنماط مثيلة، وأستلة تسهيل التحليل GC-MS وفريد تميز العقد غليكان المكونة في الأصلي البوليمر غليكان سليمة 41 (الشكل 2). 33 في نهاية المطاف، وهذا الإجراء ينتج صورة مركبة لجميع glycans في biofluid مجمع على أساس والتقدير الكمي النسبي المباشر من الميزات غليكان فريدة مثل "fucosylation الأساسية"، "6-sialylation"، "تتوسط GlcNAc"، و "بيتا 1-6 المتفرعة" – كل مستمدة من chromatograp GC-MS واحدقمة التحالف الدولي للموئل. تقدم هذه المقالة مزيد من التحسين من permethylation، أستلة، والعزلة، ومراحل تنظيف جنبا إلى جنب مع تحسينات في طريقة تقدير نسبي.
بشكل عام، وإنتاج ناجحة من الأسيتات alditol مميثل جزئيا (PMAAs) من hexoses محفوف صعوبات أقل وأكثر قوة من الإنتاج الناجح لN -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. الآلية الدقيقة وراء هذه الظاهرة كما أنه يلعب بها في كل خطوة من هذا الإجراء غير معروف، ولكن يجب أن تتصل الكيمياء فريد من مجموعة -acetyl …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the College of Liberal Arts and Sciences of Arizona State University in the form of laboratory startup funds to CRB. It was also supported by a grant from Flinn Foundation (Grant No. 1977) and by the National Cancer Institute of the National Institutes of Health under Award Number R33CA191110. JA was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health Postbaccalalureate Research Education Program (PREP) under award number R25GM071798. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Sodium hydroxide beads | 367176 | Sigma-Aldrich | 20-40 mesh, reagent grade 97% |
0.9 mL Spin column | 69705 | Pierce division of ThermoFisher Scientific | Includes plugs and polyethylene frits |
GC-MS autosampler vial (silanized)* | C4000-9 | ThermoFisher Scientific | Target DP High Recovery Vial, 1.5 mL, 12 x 32 mm, Includes Teflon-lined pierceable caps |
1.5 mL polypropylene test tubes | 05-402-25 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
2 mL polypropylene test tubes | 05-408-138 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D8418 | Sigma-Aldrich | BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0% |
Iodomethane | I8507 | Sigma-Aldrich | Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99% |
Acetonitrile | A955-4 | ThermoFisher Scientific | Optima LC/MS |
Microcentrifuge | 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424 |
13 x 100 glass test tube (silanized)* | 53283-800 | VWR | 13 x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish |
Caps for glass test tubes | 14-930-15D | ThermoFisher Scientific | Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner. |
Sodium chloride | S7653 | Sigma-Aldrich | >99.5% pure |
Chloroform | 4440-08 | Macron Fine Chemicals | |
Trifluoroacetic acid | 299537 | Sigma-Aldrich | 99% purified by redistillation for protein sequencing |
Sodium borohydride | 71321 | Fluka Analytical | 99% |
Ammonium hydroxide solution | 320145 | Sigma-Aldrich | NH3 content: 28.0 – 30.0% |
Methanol | AH230-4 | Honeywell Burdick & Jackson | HPLC grade |
Acetic acid | 320099 | Sigma-Aldrich | 99.70% |
Plastic vacuum desiccator | Any model of adequate size | FoodSaver | |
Acetic anhydride | 539996 | Sigma-Aldrich | 99.50% |
Dichloromethane | D143SK-4 | ThermoFisher Scientific | Stabilized HPLC grade |
Acetone | 9006-03 | J.T.Baker | Baker Analyzed |
Heated evaporation manifold (main unit) | pi18823 | ThermoFisher Scientific | Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function |
Heated evaporation manifold (overhead evaporator) | pi18826 | ThermoFisher Scientific | ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module |
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold | pi18816 | ThermoFisher Scientific | Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13mm dia test tubes, 13 holes (14 dia. x 45mm deep) |
Gas chromatograph | Model A7890 | Agilent | Equipped with CTC PAL autosampler |
Mass spectrometer | GCT Premier (Time-of-Flight) | Waters | |
Split-mode liner (deactivated / silanized) | 5183-4647 | Agilent | Containing a small plug of silanized glass wool |
DB-5ms GC column | 122-5532 | Agilent | 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness |
Chlorotrimethylsilane | 95541 | Sigma-Aldrich | |
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) | EW-06536-30 | Cole-Parmer | 12" wide; 230 mm plate size |
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator. |