El análisis de glicanos Nodo: un enfoque de abajo hacia arriba para Glicómica

Summary

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Abstract

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides (“glycan nodes”) present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

Introduction

Los glicolípidos, glicoproteínas, proteoglicanos, y glicosaminoglicanos constituyen las cuatro clases principales de carbohidratos complejos y heterogéneos conocidos colectivamente como glicanos. Como componentes ubicuas e integrales de la membrana plasmática, glycocalyx, y la matriz extracelular y los líquidos, los glicanos participan en diversos procesos tales bioquímicos como la endocitosis, el tráfico intracelular, la motilidad celular, la transducción de señales, reconocimiento molecular, la activación del receptor, la adhesión celular, la interacción huésped-patógeno , comunicación, inmunovigilancia, y la iniciación respuesta inmune intercelular. ¹ presente en casi todos los ámbitos de la vida, las enzimas conocidas como glicosiltransferasas que se acumulan polímeros de glicano actuar en conjunto con glucósido hidrolasas (también conocidos como glicosidasas, que se descomponen glicanos) para construir, remodelar, y finalmente producir polímeros finalizado glicanos ^2. Aunque cada glicosiltransferasa puede operar en diferentes glicoconjugados, una glicosiltransferasageneralmente forja una de ligamiento y de anómero específico de enlace glicosídico mediante la transferencia de la fracción de monosacáridos de un determinado nucleótido activado azúcar donante (por ejemplo, GDP-fucosa) a una determinada categoría de aceptores nucleófilos (por ejemplo, un lípido, polipéptido, ácido nucleico, o en crecimiento oligosacárido). Se ha estimado que más del 50% de proteínas (especialmente proteínas de membrana y de secreción) son después de la traducción modificado por glicosilación ³ cálculos combinatorios rudimentarios proporcionar una apreciación de la variabilidad considerable, versatilidad y especificidad concedido a glicoproteínas de glicosilación.; por ejemplo, si un sustrato polipéptido tiene sólo 10 sitios de glicosilación y cada sitio se puede formar un enlace glicosídico con 1 de extremos reductores solamente 3 de monosacáridos diferentes, entonces, teóricamente, la glicoproteína final puede asumir 3 ¹⁰ = 59.049 identidades distintas. En glicoproteínas, enlaces glicosídicos forman comúnmente con la cadena lateral de nitrógeno oresiduos f asparagina en la secuencia Asn-X-Ser / Thr (X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina) para producir N -glycans ² y de la cadena lateral hidroxilos de residuos de serina y treonina para dar O -glycans ^4. La composición de glicoma de una célula (es decir, su complemento de los productos de glicosilación) es único y limitado, ya que, con pocas excepciones, las glicosiltransferasas exhiben estricta donante, aceptor, y la especificidad de ligamiento. ⁵ glicoproteínas plasma sanguíneo importantes y abundantes sufren glicosilación aberrante como consecuencia de aguas abajo de expresión de glicosiltransferasa anormal y la actividad debido a muchas condiciones patológicas, especialmente cáncer y enfermedades inflamatorias. ^6-24

Principalmente debido a factores epigenéticos, la glicoma es significativamente más diverso, dinámico y complejo que el proteoma y transcriptome ^25,26. Mientras que aproximadamente 1% del genoma de mamíferos codifica la formación, modificación, ymontaje de glicanos, ²⁷ procede de glicosilación de una manera-un marcado contraste impulsado la no-plantilla para la biosíntesis del polipéptido y ácido nucleico. La interacción entre la cantidad relativa y la actividad de las enzimas de glicosilación y los factores ambientales tales como la disponibilidad de nutrientes y precursor en última instancia, determina la naturaleza, la velocidad y grado de glicosilación. ^5,28 embriogénesis (por ejemplo, la determinación y diferenciación), la activación celular y la progresión a través la expresión del gen influencia del ciclo celular (es decir, transcripción y traducción) y alterar la identidad y cantidad de glicosiltransferasas disponibles, cuya actividad es el determinante aguas arriba inmediata de perfil de glicano de la célula. Debido a que (algunos de) la proliferativa, adhesivo, y las propiedades invasivas de las células cancerosas se parecen a los de las células embriogénicas ordinarias, cambios específicos en las rutas biosintéticas de glicano (por ejemplo, la acumulación de precursor, la expresión desregulada, aberranmodificación t, truncamiento estructural, o una novela formación) sirven biomarcadores de cáncer como universales que indican diversas etapas de la formación del tumor, progresión, migración y la invasión ²⁹ Aunque la glicosilación es muy compleja, evidentemente, sólo unas pocas alteraciones en la glicosilación pueden permitir la carcinogénesis y la metástasis.; Al parecer, algunos productos de glicosilación "aberrantes" de hecho se benefician células cancerosas por lo que les permite evitar el reconocimiento inmune y sobrevivir a las exigencias de la migración en ambientes inhóspitos intravasculares y metastásicos. ^28,30,31 Como era de esperar, los experimentos han revelado que la interrupción o la prevención de los patrones de alteración la expresión del gen y la formación de glicano aberrante puede detener la tumorigénesis. ²⁹ no obstante, los glicanos aberrantes detectados en una muestra de biofluido (por ejemplo, orina, saliva, y el plasma sanguíneo o suero) pueden no ser indicadores directos de cáncer (u otra enfermedad), pero en lugar de aguas abajo resultados de sutil pero significativacambios en el sistema inmune o ramificaciones cuantificables de una condición perniciosa en un órgano impredecible. ³²

A pesar de que proporcionan información acerca de la glicoma universales, muchas técnicas basadas en glicómica de interacción molecular (por ejemplo, lectina arrays de anticuerpos y / metabólica / marcaje covalente) dependerá de la detección de estructuras de glicano enteros y no proporcionan información estructural detallada sobre glicanos individuales. En marcado contraste, la espectrometría de masas (MS) puede ayudar a identificar y cuantificar las estructuras de glicano individuales y revelar información estructural como los sitios de unión a núcleos de polipéptidos. expresión o actividad de sólo una glicosiltransferasa Desregulado pueden iniciar una cascada de eventos moleculares perjudiciales en múltiples vías de glicosilación. Debido a que cada glicosiltransferasa puede operar en más de un sustrato glicoconjugado ya través de diferentes polímeros de glicanos en crecimiento, cascadas biosintéticas desreguladas dió desproporcionalmente mayores cantidades de un solo producto de glicano, sino varias clases heterogéneas de glicanos aberrantes en los fluidos intra o extracelulares. ³³ Sin embargo, tales glicanos aberrantes únicos a veces se consideran poco práctico como biomarcadores para el cáncer u otras patologías de glicano-afectivo, ya que, en comparación con la gran piscina de glicanos bien regulada, estos glicanos aberrantes representan una fracción muy pequeña que a menudo pueden permanecer indetectable incluso por tales técnicas altamente sensibles como la espectrometría de masas. Por ejemplo, en los fluidos corporales intra y extracelulares, el amplio espectro de proteínas de concentración (que abarca ocho órdenes de magnitud) puede impedir la detección de glicoproteínas escasos que están enmascarados por las especies más abundantes. ³² Por otra parte, determinar la actividad de glicosiltransferasa sigue habiendo una considerable práctica y el desafío teórico porque muchas glicosiltransferasas están ausentes en fluidos biológicos o clínicos vuelven inactivas ex vivo. A pesar de la dificultad del consistently detección y cuantificación de cantidades diminutas de ultra-glicanos enteros únicos, los profesionales de la espectrometría de masas han dado grandes pasos hacia el empleo de glucanos intactos como marcadores clínicos. Hemos desarrollado recientemente un enfoque complementario para el análisis de glucanos intactos que, empleando GC-MS, facilita la detección de todos los constituyente punto de ramificación y monosacáridos-vinculación específica ( "nodos de glicano") que juntos confieren singularidad a cada glicano y en muchos casos sirven directamente como sustitutos moleculares que cuantifican la actividad relativa de la glicosiltransferasa (s) culpable.

Desde su primera informó de aplicación directa en el análisis de glicanos en 1958, cromatografía de gases (GC) ha demostrado ser una técnica poderosa para analizar mono- y disacáridos per-metilado, ³⁴ determinar su anomericity y configuración absoluta, y separarlos para el análisis de espectrometría de masas posterior. ³⁵ entre 1984 y 2007, y sus colegas Ciucanuintrodujo y refinó una técnica permetilación glicanos en fase sólida que emplea hidróxido de sodio y yodometano, seguido de extracción líquido / líquido de glicanos permetilados con agua y. cloroformo ^35,36 Entre 2005 y 2008, Kang y compañeros de trabajo integrados un giro de ahorro de tiempo -column enfoque en el paso permetilación ^37,38. En 2008, el grupo de investigación Goetz ideó una fase sólida cuantitativa permetilación método de glicano de perfiles utilizando láser de desorción-ionización asistida por matriz (MALDI) espectrometría de masas para comparar y diferenciar potencialmente invasivas y no las células de cáncer de mama no invasiva; ³⁹ entonces, en 2009, el equipo de técnicas de liberación químicos Goetz enzimática y combinado para escindir O -glycans de glicoproteínas intactas en un esquema permetilación en fase sólida altamente alcalina ⁴⁰ Aunque el procedimiento Goetz facilitó permetilación simultánea y las emisiones químicas. de -glycans O, se aplica sólo a pre-aislado glicoproteínas. Hemos modificado esta técnica en 2013 y lo adaptó para fluidos biológicos no fraccionadas enteros y muestras de tejido homogeneizadas mediante la incorporación de ácido trifluoroacético (TFA) hidrólisis, reducción y acetilación pasos. ³³ Estos pasos adicionales también la liberación de los glicanos de glicolípidos y N -vinculada glicanos de glicoproteínas y convertir ellos en acetatos parcialmente metilados de alditol (PMAAs, Figura 1), cuyos patrones de metilación y acetilación distintivo facilitar el análisis por GC-MS y únicamente caracterizar los nodos de glicano constituyentes en el original polímero glicano intactas ⁴¹ (Figura 2). ³³ en última instancia, este procedimiento produce un retrato compuesto de todos los glicanos en un biofluido complejo basado en la cuantificación directa, en relación de características únicas, tales como glicanos "fucosilación núcleo", "6-sialilación", "bisectriz GlcNAc", y "beta 1-6 de ramificación" – cada una derivada de una sola chromatograp GC-MSpico de HIC. Este artículo presenta una mayor optimización de la permetilación, acetilación, el aislamiento, y las etapas de limpieza, junto con mejoras en el modo de cuantificación relativa.

Protocol

Precaución: Evitar el contacto / ojo piel con cualquiera de los reactivos utilizados en este experimento. Tras la exposición, lave bien el área afectada con agua y acudir al médico inmediatamente. 1. permetilación y glicanos Extracción Preparación de la columna Obtener el máximo de unidades de columna de microcentrífuga giro como las muestras a analizar. Romper y separar las tapas de los tubos de depósito de plástico. Colocar un filtro de microcent…

Representative Results

Un cromatograma de la corriente de iones total (TIC) que muestra permetilación éxito, hidrólisis, reducción, y la acetilación de las muestras de plasma sanguíneo humano con respecto a los casos en los que se ejecutan incorrectamente dos pasos críticos permetilación se muestra en la Figura 3. Absoluta Rendimiento de HexNAcs relativa a hexosas: <p class="jove_content" fo:keep-together.within…

Discussion

En general, la producción exitosa de acetatos de alditol parcialmente metilados (PMAAs) a partir de hexosas está cargada de menos dificultades y es más robusto que el éxito de la producción de N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. El mecanismo exacto detrás de este fenómeno, ya que desempeña en cada paso de este procedimiento es desconocido, pero debe estar relacionada con la química única del grupo acetil N (en lugar de grupo hidroxilo) que es único para HexNAcs en relación con hexosas. El m…

Materials

Sodium hydroxide beads	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 mL Spin column	69705	Pierce division of ThermoFisher Scientific	Includes  plugs and polyethylene frits
GC-MS autosampler vial (silanized)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific	Target DP High Recovery Vial, 1.5 mL, 12 x 32 mm, Includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 mL polypropylene test tubes	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
2 mL polypropylene test tubes	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane	I8507	Sigma-Aldrich	Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrifuge	75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)*	53283-800	VWR	13 x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride	S7653	Sigma-Aldrich	>99.5% pure
Chloroform	4440-08	Macron Fine Chemicals
Trifluoroacetic acid	299537	Sigma-Aldrich	99% purified by redistillation for protein sequencing
Sodium borohydride	71321	Fluka Analytical	99%
Ammonium hydroxide solution	320145	Sigma-Aldrich	NH3 content: 28.0 – 30.0%
Methanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Jackson	HPLC grade
Acetic acid	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
Plastic vacuum desiccator	Any model of adequate size	FoodSaver
Acetic anhydride	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
Dichloromethane	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Stabilized HPLC grade
Acetone	9006-03	J.T.Baker	Baker Analyzed
Heated evaporation manifold (main unit)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator)	pi18826	ThermoFisher Scientific	ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold	pi18816	ThermoFisher Scientific	Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13mm dia test tubes, 13 holes (14 dia. x 45mm deep)
Gas chromatograph	Model A7890	Agilent	Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer	GCT Premier (Time-of-Flight)	Waters
Split-mode liner (deactivated / silanized)	5183-4647	Agilent	Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column	122-5532	Agilent	30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane	95541	Sigma-Aldrich
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.