The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.
جبل بأكمله في الموقع التهجين (WMISH) هي تقنية تسمح للقرار المكاني للجزيئات الحمض النووي (في كثير من الأحيان من mRNAs) ضمن إعداد الأنسجة "جبل بأكمله، أو مرحلة النمو (مثل الجنين أو يرقة) من الفائدة. WMISH هي قوية للغاية لأنها يمكن أن تساهم بشكل كبير في توصيف وظيفي من الجينوم metazoan معقدة، وهو التحدي الذي أصبح أكثر من عنق الزجاجة مع طوفان من البيانات تسلسل الجيل القادم. على الرغم من بساطة المفاهيمية للتقنية وغالبا ما يحتاج الكثير من الوقت لتحسين مختلف المعايير المتأصلة في تجارب WMISH لنظم نموذج الجديدة؛ يعني الفروق الدقيقة في خصائص الخلوية والكيمياء الحيوية بين أنواع الأنسجة والمراحل التطويرية التي أسلوب WMISH واحد قد لا يكون مناسبا لجميع الحالات. لقد قمنا بتطوير مجموعة من الأساليب WMISH لعاودت الظهور نموذج البطني المنقعية الراكدة التي تولد يتفق وإشارات WMISH واضحة لمجموعة من الجينات، وعبر جميع مراحل النمو. وتشمل هذه الأساليب احالة يرقات العمر الزمني غير معروف إلى نافذة التخلق، وإزالة فعالة للأجنة ويرقات من كبسولات البيض، وتطبيق العلاج بروتين-K المناسبة لكل نافذة التخلق، والتهجين، بعد التهجين ومناعي خطوات. وتوفر هذه الأساليب على الأساس الذي الإشارة الناتجة عن نسخة RNA معينة يمكن أن يكون مزيد من الصقل مع تعديلات محددة التحقيق (التحقيق في المقام الأول التركيز ودرجة الحرارة التهجين).
الرخويات هي مجموعة من الحيوانات التي تحمل الفائدة من تنوع واسع من التخصصات العلمية. وعلى الرغم من تنوع الصرفي من 1، ثراء الأنواع (في المرتبة الثانية بعد المفصليات من حيث عدد الأنواع 2) وصلة إلى مجموعة واسعة من التجارية 3، 4 الطبية والعلمية القضايا 5-8، هناك عدد قليل نسبيا من الأنواع الرخويات التي يمكن أن تدعي ل يكون كلا النموذجين علمية مجهزة تجهيزا جيدا وسهلة للحفاظ في بيئة معملية. واحد الرخويات التي تستخدم كثيرا من قبل التخصصات مثل علم الأعصاب 9، والسمية الإيكولوجية 10 وأكثر في الآونة الأخيرة البيولوجيا التطورية 11،12، هو المنقعية الراكدة، وذلك أساسا بسبب التوزيع على نطاق واسع وسهولة القصوى من الصيانة. وعلى الرغم من شعبيته بوصفه الكائن 'نموذج' وتاريخها الطويل من الاستخدام من قبل علماء البيولوجيا التطورية 13-19، ومجموعة وقوة الأدوات الجزيئية المتاحة للL. stagnيكمن المجتمع العلمي أليس بعيدا وراء ذلك من مزيد من النماذج التقليدية الحيوان (ذبابة الفاكهة، والماوس، قنفذ البحر والديدان الخيطية).
لدينا الرغبة في تطوير المنقعية كما ينبع نموذج جزيئي من مصلحة في الآليات الجزيئية التي توجه تشكيل قذيفة. هذا دفعنا لصقل مجموعة من التقنيات التي من شأنها أن تسمح لتصور فعال، بما يتفق وحساسة في التعبير الجيني خلال تطوير المنقعية الصورة. جبل بأكمله في الموقع التهجين (WMISH) يعمل على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من الكائنات الحية النموذج والتي تم فيها استخدام لأكثر من 40 عاما 20. في وجوهها المختلفة، ISH يمكن استخدامها في توطين مكانيا مواضع محددة على الكروموسومات، الريباسي، مرنا والرنا الصغير.
واحدة من التحديات التي تحتاج إلى معالجة قبل صقل طريقة WMISH لL. كان الراكدة قضية استخراج بلطف وكفاءة الأجنة واليرقات من مراحل متفاوتة من رانه كبسولات البيض التي يتم إيداعها. هذا الاستخلاص، أو "نزع المحفظة"، يحتاج إلى أن يتحقق بكفاءة من أجل جمع المادية الكافية لالواردة في تجربة الموقع، وفي الوقت نفسه الحفاظ على سلامة المورفولوجية والخلوية. بينما الكائنات النموذج الأخرى أيضا الخضوع لتطوير مغلفة، في أيدينا يمكن أن تستخدم أيا من الأساليب ذكرت لتلك الأنواع بنجاح في L. الراكدة.
وبالتالي فإن الأهداف العامة لهذه الطريقة هي: لاستخراج L. الراكدة الأجنة واليرقات من كبسولات بها بطريقة الإنتاجية العالية، لتطبيق علاجات ما قبل التهجين أن تحسين إشارة WMISH، لإعداد الأجنة واليرقات مع WMISHsignals مرضية للتصوير.
الطريقة الموصوفة هنا يسمح التصور الفعال للنسخ الرنا مع فرضا متفاوتة مستويات التعبير في جميع مراحل تطور المنقعية الراكدة. لإزالة الأجنة واليرقات من كبسولات بهم ونحن محاكمتهم مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية، صدمة التناضحي والمعالجات الفيزيائية وذكرت لencapsulat…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من خلال تمويل لDJJ من خلال مشروع DFG # JA2108 / 2-1.
Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION – May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION – CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION – ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION – Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION – CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION – Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION – Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION – May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION – Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION – May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION – Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION – May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |