ككل جبل<em> في الموقع</em> طريقة التهجين لالبطني الأقدام الرخويات<em> الراكدة المنقعية</em
Summary
The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.
Abstract
جبل بأكمله في الموقع التهجين (WMISH) هي تقنية تسمح للقرار المكاني للجزيئات الحمض النووي (في كثير من الأحيان من mRNAs) ضمن إعداد الأنسجة "جبل بأكمله، أو مرحلة النمو (مثل الجنين أو يرقة) من الفائدة. WMISH هي قوية للغاية لأنها يمكن أن تساهم بشكل كبير في توصيف وظيفي من الجينوم metazoan معقدة، وهو التحدي الذي أصبح أكثر من عنق الزجاجة مع طوفان من البيانات تسلسل الجيل القادم. على الرغم من بساطة المفاهيمية للتقنية وغالبا ما يحتاج الكثير من الوقت لتحسين مختلف المعايير المتأصلة في تجارب WMISH لنظم نموذج الجديدة؛ يعني الفروق الدقيقة في خصائص الخلوية والكيمياء الحيوية بين أنواع الأنسجة والمراحل التطويرية التي أسلوب WMISH واحد قد لا يكون مناسبا لجميع الحالات. لقد قمنا بتطوير مجموعة من الأساليب WMISH لعاودت الظهور نموذج البطني المنقعية الراكدة التي تولد يتفق وإشارات WMISH واضحة لمجموعة من الجينات، وعبر جميع مراحل النمو. وتشمل هذه الأساليب احالة يرقات العمر الزمني غير معروف إلى نافذة التخلق، وإزالة فعالة للأجنة ويرقات من كبسولات البيض، وتطبيق العلاج بروتين-K المناسبة لكل نافذة التخلق، والتهجين، بعد التهجين ومناعي خطوات. وتوفر هذه الأساليب على الأساس الذي الإشارة الناتجة عن نسخة RNA معينة يمكن أن يكون مزيد من الصقل مع تعديلات محددة التحقيق (التحقيق في المقام الأول التركيز ودرجة الحرارة التهجين).
Introduction
الرخويات هي مجموعة من الحيوانات التي تحمل الفائدة من تنوع واسع من التخصصات العلمية. وعلى الرغم من تنوع الصرفي من 1، ثراء الأنواع (في المرتبة الثانية بعد المفصليات من حيث عدد الأنواع 2) وصلة إلى مجموعة واسعة من التجارية 3، 4 الطبية والعلمية القضايا 5-8، هناك عدد قليل نسبيا من الأنواع الرخويات التي يمكن أن تدعي ل يكون كلا النموذجين علمية مجهزة تجهيزا جيدا وسهلة للحفاظ في بيئة معملية. واحد الرخويات التي تستخدم كثيرا من قبل التخصصات مثل علم الأعصاب 9، والسمية الإيكولوجية 10 وأكثر في الآونة الأخيرة البيولوجيا التطورية 11،12، هو المنقعية الراكدة، وذلك أساسا بسبب التوزيع على نطاق واسع وسهولة القصوى من الصيانة. وعلى الرغم من شعبيته بوصفه الكائن 'نموذج' وتاريخها الطويل من الاستخدام من قبل علماء البيولوجيا التطورية 13-19، ومجموعة وقوة الأدوات الجزيئية المتاحة للL. stagnيكمن المجتمع العلمي أليس بعيدا وراء ذلك من مزيد من النماذج التقليدية الحيوان (ذبابة الفاكهة، والماوس، قنفذ البحر والديدان الخيطية).
لدينا الرغبة في تطوير المنقعية كما ينبع نموذج جزيئي من مصلحة في الآليات الجزيئية التي توجه تشكيل قذيفة. هذا دفعنا لصقل مجموعة من التقنيات التي من شأنها أن تسمح لتصور فعال، بما يتفق وحساسة في التعبير الجيني خلال تطوير المنقعية الصورة. جبل بأكمله في الموقع التهجين (WMISH) يعمل على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من الكائنات الحية النموذج والتي تم فيها استخدام لأكثر من 40 عاما 20. في وجوهها المختلفة، ISH يمكن استخدامها في توطين مكانيا مواضع محددة على الكروموسومات، الريباسي، مرنا والرنا الصغير.
واحدة من التحديات التي تحتاج إلى معالجة قبل صقل طريقة WMISH لL. كان الراكدة قضية استخراج بلطف وكفاءة الأجنة واليرقات من مراحل متفاوتة من رانه كبسولات البيض التي يتم إيداعها. هذا الاستخلاص، أو "نزع المحفظة"، يحتاج إلى أن يتحقق بكفاءة من أجل جمع المادية الكافية لالواردة في تجربة الموقع، وفي الوقت نفسه الحفاظ على سلامة المورفولوجية والخلوية. بينما الكائنات النموذج الأخرى أيضا الخضوع لتطوير مغلفة، في أيدينا يمكن أن تستخدم أيا من الأساليب ذكرت لتلك الأنواع بنجاح في L. الراكدة.
وبالتالي فإن الأهداف العامة لهذه الطريقة هي: لاستخراج L. الراكدة الأجنة واليرقات من كبسولات بها بطريقة الإنتاجية العالية، لتطبيق علاجات ما قبل التهجين أن تحسين إشارة WMISH، لإعداد الأجنة واليرقات مع WMISHsignals مرضية للتصوير.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا يسمح التصور الفعال للنسخ الرنا مع فرضا متفاوتة مستويات التعبير في جميع مراحل تطور المنقعية الراكدة. لإزالة الأجنة واليرقات من كبسولات بهم ونحن محاكمتهم مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية، صدمة التناضحي والمعالجات الفيزيائية وذكرت لencapsulat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال تمويل لDJJ من خلال مشروع DFG # JA2108 / 2-1.
Materials
| Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION – May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION – CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
| Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
| Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
| Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION – ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
| Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
| Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION – Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
| Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION – CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
| Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION – Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
| Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION – Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
| Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
| Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION – May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION – Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
| N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION – May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION – Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
| Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
| Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION – May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
References
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Brusca, R. C., Brusca, G. J. . Invertebrates. , (2002).
- World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
- Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).
- Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
- Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
- Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).
- Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).
- Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).
- Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15 (1), 19 (2015).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its’ chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).
- Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).
- Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
- Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183 (1), (1973).
- Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).
- Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35 (1), 29 (1973).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).
- Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).
- Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).
- Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7 (1), 160 (2007).
- Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
- Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. , (2015).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).
- Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
- Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).
- Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).
- Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).
- Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).
- Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).
- Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).
