A Mont entier<em> In Situ</em> Méthode Hybridation pour le mollusque gastéropode<em> Lymnaea stagnalis</em
Summary
The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.
Abstract
Whole mount hybridation in situ (WMISH) est une technique qui permet la résolution spatiale des molécules d'acide nucléique (souvent ARNm) dans une préparation de tissu «tout support», ou le stade de développement (comme un embryon ou larve) d'intérêt. WMISH est extrêmement puissant car il peut contribuer de manière significative à la caractérisation fonctionnelle des génomes de métazoaires complexes, un défi qui devient de plus d'un goulot d'étranglement avec le déluge de données de séquence de la prochaine génération. En dépit de la simplicité conceptuelle de la technique de temps est souvent nécessaire d'optimiser les différents paramètres inhérents aux expériences WMISH pour les nouveaux systèmes de modèles; de subtiles différences dans les propriétés cellulaires et biochimiques entre les types de tissus et des stades de développement signifient qu'une méthode de WMISH unique peut ne pas convenir à toutes les situations. Nous avons mis au point un ensemble de méthodes WMISH pour les ré-émergentes modèle gastéropode Lymnaea stagnalis qui génèrent cohérente etsignaux WMISH clairs pour une gamme de gènes, et dans tous les stades de développement. Ces méthodes comprennent l'affectation des larves de l' âge chronologique inconnue à une fenêtre ontogénétique, l'élimination efficace des embryons et des larves de leurs capsules d'oeufs, l'application d'un traitement à la protéinase-K approprié pour chaque fenêtre ontogénétique, et l' hybridation, post-hybridation et immunodétection des pas. Ces méthodes fournissent une base à partir de laquelle le signal résultant d'une transcription d'ARN donné peut être encore affiné avec des ajustements spécifiques de la sonde (principalement sonder la concentration et la température d'hybridation).
Introduction
Les mollusques sont un groupe d'animaux qui détiennent l'intérêt d'une grande diversité de disciplines scientifiques. En dépit de leur diversité morphologique 1, la richesse en espèces ( en second lieu seulement aux arthropodes en termes de nombre d'espèces 2) et de la pertinence d'une large gamme de 3 commerciaux, médicaux et scientifiques 4 questions 5-8, il y a relativement peu d' espèces de mollusques qui peuvent prétendre à être à la fois des modèles scientifiques bien équipés et faciles à entretenir dans un environnement de laboratoire. Un mollusque qui est beaucoup utilisé par des disciplines telles que la neurobiologie 9, écotoxicologie 10 et plus récemment la biologie évolutionniste 11,12, est Lymnaea stagnalis, principalement en raison de sa large distribution et de l' extrême facilité d'entretien. En dépit de sa popularité en tant que «modèle» organisme et sa longue histoire d'utilisation par les biologistes du développement 13-19, la portée et la puissance des outils moléculaires disponibles pour le L. StAGNalis communauté scientifique est loin derrière celle des modèles plus traditionnels animaux (drosophile, souris, oursin de mer, nématodes).
Notre volonté de développer Lymnaea comme un modèle moléculaire découle d'un intérêt pour les mécanismes moléculaires qui guident la formation de la coquille. Cela nous a motivé pour affiner un ensemble de techniques qui permettraient de la visualisation efficace, cohérente et sensible de l' expression des gènes au cours du développement de l 'Lymnaea. Whole mount hybridation in situ (WMISH) est largement utilisé pour une variété d'organismes modèles et a été utilisé pendant plus de 40 ans 20. Dans ses différentes formes, ISH peut être utilisée pour localiser spatialement locus spécifiques sur des chromosomes, un ARNr, un ARNm et des micro-ARN.
L' un des défis que nous avons besoin pour faire face avant d' affiner une méthode de WMISH pour L. stagnalis était la question des embryons doucement et efficacement l' extraction et les larves de différents stades de til capsules d'oeufs dans lesquels ils sont déposés. Cette extraction ou «désencapsulation», doit être réalisée de manière efficace afin de collecter un matériel adéquat pour une donnée expérience in situ, tout en conservant l' intégrité morphologique et cellulaire. Alors que d' autres organismes modèles subissent également le développement encapsulées dans nos mains , aucune des méthodes rapportées pour ces espèces peut être employée avec succès dans L. stagnalis.
Les objectifs généraux de cette méthode sont donc: pour extraire L. stagnalis embryons et des larves de leurs capsules dans un mode à haut débit, d'appliquer des traitements de pré-hybridation qui optimisent le signal de WMISH, pour préparer des embryons et des larves avec WMISHsignals satisfaisantes pour l' imagerie.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici permet la visualisation efficace des transcrits d'ARN avec vraisemblablement des niveaux variables d'expression au sein de tous les stades de développement de Lymnaea stagnalis. Pour supprimer des embryons et des larves de leurs capsules , nous trialed une variété de traitements chimiques et physiques, un choc osmotique et rapporté pour d' autres encapsulated- le développement des organismes modèles. Cependant, dans nos mains la méthode que nous décrivons ici est la …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un financement à DJJ à travers le projet DFG # JA2108 / 2-1.
Materials
| Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION – May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION – CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
| Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
| Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
| Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION – ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
| Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
| Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION – Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
| Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION – CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
| Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION – Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
| Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION – Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
| Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
| Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION – May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION – Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
| N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION – May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION – Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
| Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
| Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION – May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
References
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