全体のマウント<em>その場で</em腹足類軟体動物のための>ハイブリダイゼーション法<em>モノアラガイstagnalis</em
Summary
The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.
Abstract
in situハイブリダイゼーション（WMISH） で全体のマウント興味のある（例えば、胚または幼虫など）「ホールマウント」組織標本、または発達段階内の核酸分子（多くの場合のmRNA）の空間分解能を可能にする技術です。それはかなり複雑な後生動物ゲノムの機能解析、次世代シーケンスデータの大洪水でボトルネックをより多くなってきている課題に貢献することができるので、WMISHは非常に強力です。技術に多くの時間の概念シンプルさにもかかわらず、多くの場合、新たなモデル系のためのWMISH実験に固有の様々なパラメータを最適化するために必要とされます。組織型と発達段階の間の細胞および生化学的特性の微妙な違いは、単一WMISH方法がすべての状況に適切ではないかもしれないことを意味します。我々は一貫生成し、再新興腹足類モデルモノアラガイのstagnalisためWMISHメソッドのセットを開発しています遺伝子の、およびすべての発達段階全体の範囲について明確なWMISH信号。これらの方法は、個体発生のウィンドウに未知の暦年齢の幼虫の割り当て、それらの卵のカプセルからの胚および幼生の効率的な除去、各個体発生のウィンドウのための適切なプロテイナーゼK処理の適用、およびハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション後および免疫検出、ステップ。これらのメソッドは、指定されたRNA転写物について得られた信号は、プローブ固有の調整（主にプローブ濃度及びハイブリダイゼーション温度）でさらに洗練することができ、そこから基盤を提供します。
Introduction
軟体動物は、科学分野の幅広い多様性の持分を保有動物の群です。その形態的多様性1、（種数2の点で第のみ節足動物への）種の豊かさや商業3、医学4及び科学的問題5-8の広い範囲との関連性にもかかわらず、に主張することができ、比較的少数の軟体動物の種があります設備の整った科学的なモデルと実験室環境で維持しやすいの両方です。多くのそのような神経生物学9、生態毒性10、より最近では進化生物学11,12などの分野で使用されている一つの軟体動物は、主に、その広範な分布およびメンテナンスの極度の容易さのため、モノアラガイのstagnalisです。 「モデル」生物としての人気とLに利用できる発達生物学者13-19、分子ツールの範囲とパワーによる使用の長い歴史にもかかわらず、 stagnALIS科学コミュニティは、はるかに多くの伝統的な動物モデル（ ショウジョウバエ 、マウス、ウニ、線虫）の背後にあります。
分子モデルとしてモノアラガイを開発することが私たちの願いは、シェル形成を誘導する分子機構への関心から生じます。これはモノアラガイの発達中の遺伝子発現の、効率的で一貫性のある敏感な可視化を可能にする技術のセットを絞り込むために私たちの動機。 in situハイブリダイゼーションホールマウント（WMISH）が広くモデル生物のさまざまな使用され、40年以上20のために使用されてきました。その異なる装いで、ISHは空間的に染色体、リボソームRNA、mRNAおよびマイクロRNAは上の特定の遺伝子座をローカライズするために使用することができます。
私たちは前L.ためWMISH方法を精緻化に対処するために必要な課題の一つstagnalisは静かにかつ効率的に抽出する胚およびトンから様々な段階の幼虫の問題でした彼それらが積層された卵のカプセル。この抽出、または「脱カプセル化」は、同時に形態学的および細胞の完全性を維持しながら、 その場での実験で与えられるために十分な材料を収集するために効率的に達成する必要があります。他のモデル生物はまた、カプセル化された開発を受けている間、我々の手でこれらの種について報告された方法のいずれもが正常L.において使用することができませんでしたstagnalis。
この方法の全体的な目標は、したがって、次のとおりです。L.を抽出するために、イメージングのための十分なWMISHsignalsで胚および幼虫を準備するために、WMISH信号を最適化するプレハイブリダイゼーション処理を適用するために、ハイスループット様式でそのカプセルから胚および幼生をstagnalis。
Protocol
注：以下の手順は、Lの胚および幼生期にその場での実験で行うための我々の方法を概説しますステップはこれが単語'注意'で示され、すべての適切な安全手順が採用されるべき有害化学物質の使用を伴うstagnalis。有害化学物質のための代表的なMSDSシートへのリンクは、 補足ファイル1で提供されている。全ての試薬 のためのレシピは、 <strong…
Representative Results
図3に示される代表的なWMISH染色パターンは、上述の技術を用いて生成され、分子のシェルの形成に至るまでの処理（ 新規遺伝子1、2、3、4）の範囲に関与する遺伝子のための空間的な発現パターンの多様性を反映し、細胞間シグナル伝達（DPP）への発達段階の範囲にわたって転写調節（ ブラキュリ ）へ。一方で我々は、我々の…
Discussion
ここで説明する方法はモノアラガイstagnalisのすべての発達段階内で、おそらく様々な発現レベルを有するRNA転写物の効率的な可視化を可能にする。そのカプセルから胚および幼生を削除するには、我々は他のencapsulated-に対して報告化学物質、浸透圧ショックおよび物理的処理の様々な試用しましたモデル生物を開発。しかし、私たちの手の中に私たちがここで説明する方法は、…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、DFGプロジェクト＃1 JA2108 / 2-1を通じてDJJに資金調達によってサポートされていました。
Materials
| Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION – May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION – CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
| Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
| Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
| Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION – ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
| Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
| Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION – Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
| Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION – CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
| Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION – Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
| Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION – Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
| Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
| Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION – May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION – Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
| N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION – May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION – Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
| Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
| Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION – May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
References
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Citer Cet Article
Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis. J. Vis. Exp. (109), e53968, doi:10.3791/53968 (2016).