전체 산<em> 현장에서</em복족류 연체 동물 용> 하이브리드 방법<em> Lymnaea의 stagnalis</em
Summary
The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.
Abstract
현장 하이브리드의 전체 마운트 (WMISH는) 관심 (예 : 태아 또는 애벌레 같은)에 '전체 마운트'조직 준비 내의 핵산 분자 (보통의 mRNA)의 공간 해상도, 또는 발달 단계를 위해 할 수있는 기술이다. 따라서 매우 복잡한 후생 동물 게놈의 기능적 특성, 차세대 시퀀스 데이터의 범람에 병목이 더 있다는 반칙에 기여할 수 있기 때문에 WMISH은 매우 강력하다. 많은 시간은 종종 새로운 모델 시스템 WMISH 실험에 고유 한 각종 파라미터를 최적화하는데 필요한 기술의 개념적 단순함에도 불구하고; 조직 유형 및 발달 단계의 세포 및 생화학 적 특성의 미묘한 차이는 하나의 WMISH 방법은 모든 상황에 적합하지 않을 수 있다는 것을 의미한다. 우리는 일관 생성하고 다시 새로운 복족류 모델 Lymnaea의 stagnalis에 대한 WMISH 방법의 세트를 개발했다유전자의 모든 발달 단계에 걸쳐 범위에 대한 명확한 WMISH 신호. 이러한 방법은 개체 발생 창에 알 수없는 연대기 나이의 애벌레의 할당, 자신의 계란 캡슐에서 효율적으로 배아를 제거하고 유충, 각각의 개체 발생 창에 적절한 테-K 치료의 응용 프로그램 및 하이브리드, 이후 하이브리드 및 면역을 포함 단계. 이 방법은 주어진 RNA 전 사체에 대한 결과 신호는 프로브 특정 조정 (주로 농도와 혼성화 온도 프로브)을 추가로 정제 할 수있는 기반을 제공합니다.
Introduction
연체 동물은 과학 분야의 폭 넓은 다양성의 관심을 보유 동물의 그룹입니다. 자신의 형태 학적 다양성 (1)에도 불구하고, 종, 3 상업 의료 4 및 과학 문제 5-8의 넓은 범위와 관련 (종수 (2)의 관점에서 만 절지로 두 번째) 풍요 로움을 주장 할 수있다 상대적으로 적은 연체 동물 종들이있다 잘 갖추어 진 과학 모델과 실험실 환경에서 유지 보수가 용이 모두합니다. 많은 등의 신경 생물학 9, 생태 독성학 (10)과 최근 진화 생물학 11, 12 등의 분야에서 사용되는 하나의 연체 동물은 주로 때문에 광범위하게 배포 및 유지 보수의 극단적 인 용이성, Lymnaea의 stagnalis입니다. 는 '모델'유기체로서의 인기와 L. 사용할 발달 생물 학자 13-19, 분자 도구의 범위와 능력으로 사용의 오랜 역사에도 불구하고 stagnALIS 과학 사회는 훨씬 더 전통적인 동물 모델 (초파리, 마우스, 성게, 선충)의 뒤에 자리 잡고 있습니다.
분자 모델 쉘 형성을 유도 분자 메커니즘에 대한 관심에서 비롯된 우리의 욕망은 Lymnaea을 개발. 이 Lymnaea의 개발 기간 동안 유전자 발현의 효율적이고 일관성있는 민감한 시각화 허용하는 기술의 집합을 수정하는 동기를 부여. 현장 하이브리드의 전체 마운트 (WMISH)는 널리 모델 생물의 다양한 채용되며, 40 년 이상 20 사용되었습니다. 그 다른 guises에서 ISH 공간적 염색체 rRNA의, mRNA의 마이크로 RNA를 특정 유전자좌 국산화 사용될 수있다.
과제 중 하나는 이전 L.하는 WMISH 방법 정련 해결할 필요 stagnalis 부드럽게하고 효율적으로 추출하는 배아와 t에서 다양한 단계의 애벌레의 문제였다그는 그들이 퇴적 된 계란 캡슐. 이는 추출 또는 '캡슐화'는에 적합한 재료를 수집하기 위해 효율적으로 달성 할 필요가있는 동시에 형태 및 세포의 무결성을 유지하면서, 현장 실험에서 주어진. 다른 모델 생물도 캡슐화 개발을 겪는 동안, 우리 손에 그 종에 대해보고 된 방법 중 어느 것도 성공적 L.에 사용되지 않았다 stagnalis.
이 방법의 전반적인 목표는 따라서 다음과 같습니다 L.를 추출 stagnalis 높은 처리량 방식으로 그들의 캡슐에서 배아 및 유충 이미징을위한 만족스러운 WMISHsignals와 배아 및 유충을 준비하려면 WMISH 신호를 최적화 사전 하이브리드 치료를 적용합니다.
Protocol
참고 : 다음 단계는 L.의 배아와 애벌레 단계에서 현장 실험의를 수행하기위한 우리의 방법을 간략하게 설명 공정이 단어 '주의'와 모든 적절한 안전 절차에 의해 지시 된 유해 화학 물질의 사용을 포함 stagnalis이. 채용한다. 유해 화학 물질에 대한 대표 MSDS 시트에 대한 링크는 보조 파일 (1)에 제공됩니다. 모든 시약에 대한 조리법은 보조 파일이 …
Representative Results
도 3에 도시 된 대표적인 WMISH 염색 패턴이 상술 한 기술을 이용하여 생성하고, 쉘의 형성에 이르기까지의 분자 다양한 프로세스에 관여하는 유전자에 대한 공간 발현 패턴의 다양한 반영 하였다 (신규 유전자 1, 2, 3, 4) 개발 단계의 범위에 걸쳐 전사 조절 (Brachyury)으로 세포 – 세포 신호 (DPP)에 관한 것이다. 우리는 그들이 같은 것이라…
Discussion
여기에 설명 된 방법은 Lymnaea stagnalis의 모든 개발 단계에서 아마도 다양한 발현 수준과 RNA 전 사체를 효율적으로 시각화 할 수 있습니다. 그들의 캡슐에서 배아 및 유충을 제거하려면 우리가 다른 encapsulated-보고 화학, 삼투압 충격 및 물리적 처리의 다양한 평가판을 모델 생물을 개발하고 있습니다. 그러나, 우리의 손에 우리는 여기에서 설명하는 방법은 배아와 유충 손상없이…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 DFG 프로젝트 #의 JA2108 / 2-1를 통해 DJJ에 자금에 의해 지원되었다.
Materials
| Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION – May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION – CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
| Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
| Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
| Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION – ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
| Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
| Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION – Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
| Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION – CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
| Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION – Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
| Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION – Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
| Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
| Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION – May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION – Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
| N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION – May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION – Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
| Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
| Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION – May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
References
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Citer Cet Article
Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis. J. Vis. Exp. (109), e53968, doi:10.3791/53968 (2016).