The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.
Hele mount in situ hybridisering (WMISH) er en teknikk som gjør det mulig for den romlige oppløsningen på nukleinsyremolekyler (ofte mRNA) innenfor en hel mount 'vev forberedelse, eller utviklingsstadiet (slik som et embryo eller larve) av interesse. WMISH er ekstremt kraftig, fordi det kan bidra vesentlig til den funksjonelle karakterisering av komplekse metazo genomer, en utfordring som blir stadig mer av en flaskehals med oversvømmelse av neste generasjons sekvensdata. Til tross for den konseptuelle enkelheten av teknikken mye tid er ofte nødvendig for å optimalisere de ulike parameterne som ligger til WMISH eksperimenter for nye modellsystemer; små forskjeller i de cellulære og biokjemiske egenskaper mellom vevstyper og utviklingsstadier bety at en enkelt WMISH metoden ikke kan være hensiktsmessig for alle situasjoner. Vi har utviklet et sett av WMISH metoder for re-fremvoksende gastropod modell stor damsnegl som genererer konsekvent ogklare WMISH signaler for en rekke gener, og på tvers av alle utviklingsstadier. Disse metodene inkluderer tildeling av larver av ukjent kronologiske alder til en ontogenetisk vindu, effektiv fjerning av embryoer og larver fra sine egg kapsler, anvendelse av en passende proteinase-K behandling for hver ontogenetisk vinduet, og hybridisering, post-hybridisering og immundeteksjon trinn. Disse metodene gir et grunnlag for det resulterende signal for en gitt RNA-transkript kan være ytterligere raffinert med probe spesifikk justering (primært probe konsentrasjon og hybridisering temperatur).
Bløtdyr er en gruppe dyr som holder interessen for et bredt mangfold av vitenskapelige disipliner. Til tross for deres morfologisk mangfold 1, artsrikdom (andre bare til Leddyr i form av arter nummer to) og relevans for et bredt spekter av kommersielle 3, medisinsk 4 og vitenskapelige spørsmål 5-8, er det relativt få bløtdyr arter som kan hevde å være både velutstyrte vitenskapelige modeller og lett å vedlikeholde i et laboratoriemiljø. En bløtdyr som er mye brukt av disipliner som nevrobiologi 9, økotoksikologi 10 og mer nylig evolusjonsbiologi 11,12, er stor damsnegl, først og fremst på grunn av sin omfattende distribusjon og ekstrem enkelt vedlikehold. Til tross for sin popularitet som en "modell" organisme og dens lange historie med bruk av utviklings biologer 13-19, omfanget og kraften av molekylære verktøy tilgjengelig for L. stagnAlis vitenskapelige samfunnet ligger langt bak at mer tradisjonelle dyremodeller (Drosophila, mus, kråkeboller, nematoder).
Vårt ønske om å utvikle Lymnaea som en molekylær modell stammer fra en interesse i de molekylære mekanismene som styrer skalldannelsen. Dette motiverte oss til å avgrense et sett av teknikker som ville tillate for effektiv, konsekvent og sensitiv visualisering av genuttrykk under Lymnaea utvikling. Hele mount in situ hybridisering (WMISH) er mye brukt for en rekke modellorganismer og har vært i bruk i mer enn 40 år 20. I sine forskjellige forkledninger, kan ISH brukes til romlig lokalisere bestemte loci på kromosomene, rRNA, mRNA og mikro-RNA.
En av utfordringene vi trengte å ta før raffinering en WMISH metode for L. stagn var spørsmålet om forsiktig og effektivt trekke ut embryoer og larver av varierende stadier fra than egg kapsler hvor de er avsatt. Denne ekstraksjon, eller 'decapsulation', som må oppnås effektivt for å samle tilstrekkelig materiale for en gitt in situ forsøk, mens det på samme tid opprettholde morfologiske og cellulær integritet. Mens andre modellorganismer også gjennomgå innkapslet utvikling i våre hender ingen av metodene som er rapportert for disse artene kan være vellykket ansatt i L. stagn.
De overordnede målene for denne metoden er derfor: å trekke L. stagn embryoer og larver fra sine kapsler i en high-throughput mote, for å bruke pre-hybridisering behandlinger som optimaliserer WMISH signal, for å forberede embryoer og larver med tilfredsstillende WMISHsignals for bildebehandling.
Fremgangsmåten som er beskrevet her gjør det mulig for effektiv visualisering av RNA-transkripter med antagelig varierende ekspresjonsnivåer i alle utviklingsstadier av stor damsnegl. For å fjerne embryoer og larver fra sine kapsler vi trialed en rekke kjemiske, osmotisk sjokk og fysiske behandlinger er rapportert for andre encapsulated- utvikle modellorganismer. Men i våre hender metoden vi beskriver her er det bare høy gjennomstrømming teknikk som fjerner den tøffe kapsel membranen uten å skade befru…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av midler til DJJ gjennom DFG prosjekt # JA2108 / 2-1.
Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION – May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION – CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION – ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION – Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION – CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION – Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION – Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION – May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION – Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION – May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION – Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION – May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |