The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.
Hela montera in situ hybridisering (WMISH) är en teknik som gör det möjligt för den rumsliga upplösningen av nukleinsyramolekyler (ofta mRNA) i en "hela berget" vävnadspreparat, eller utvecklingsstadiet (t.ex. ett embryo eller larv) av intresse. WMISH är extremt kraftfull, eftersom det kan bidra avsevärt till den funktionella karakteriseringen av komplexa flercelliga genom, en utmaning som blir mer av en flaskhals med störtflod av nästa generations sekvensdata. Trots den konceptuella enkelheten i tekniken behövs ofta mycket tid att optimera de olika parametrarna inneboende WMISH experiment för nya modellsystem; subtila skillnader i de cellulära och biokemiska egenskaper mellan vävnadstyper och utvecklingsstadier innebär att en enda WMISH metoden inte kan vara lämpliga för alla situationer. Vi har utvecklat en uppsättning WMISH metoder för återkommande gastropod modell lymnaea stagn som genererar konsekvent ochtydliga WMISH signaler för ett antal gener, och i alla utvecklingsstadier. Dessa metoder innefattar tilldelningen av larver av okänt kronologisk ålder till en ontogenetiska fönster, det effektiva avlägsnandet av embryon och larver från sina ägg kapslar, tillämpningen av en lämplig proteinas-K-behandling för varje ontogenetiska fönster, och hybridisering, post-hybridisering och immunodetection steg. Dessa metoder ger en grund från vilken den resulterande signalen för en given RNA-transkript kan ytterligare förfinas med sond specifik justeringar (primärt probkoncentration och hybridiseringstemperaturen).
Blötdjur är en grupp av djur som håller intresset av ett brett spektrum av vetenskapliga discipliner. Trots deras morfologiska mångfald en art, rikedom (näst efter Leddjur i fråga om art nr 2) och relevans för ett brett spektrum av kommersiella 3, medicinska 4 och vetenskapliga frågor 5-8, finns det relativt få blötdjur arter som kan göra anspråk på att vara både välutrustade vetenskapliga modeller och lätt att underhålla i laboratoriemiljö. En blötdjur som mycket används av discipliner såsom neurobiologi 9, ekotoxikologi 10 och mer nyligen evolutionsbiologi 11,12, är lymnaea stagn, främst på grund av dess omfattande spridning och extrem enkelt underhåll. Trots sin popularitet som en modell organism och dess långa historia av användning av utvecklingsbiologer 13-19, utbudet och kraften i molekylära verktyg tillgängliga för L. stagnalis vetenskapliga samfundet ligger långt efter det att mer traditionella djurmodeller (Drosophila, mus, sjöborre, nematoder).
Vår önskan att utveckla lymnaea som en molekylmodell härrör från ett intresse för de molekylära mekanismer som styr skalbildning. Detta motiverade oss att förfina en uppsättning tekniker som gör det möjligt för en effektiv, konsekvent och känslig visualisering av genuttryck under lymnaea utveckling. Hela montera in situ hybridisering (WMISH) är allmänt används för en mängd olika modellorganismer och har använts i mer än 40 år 20. I dess olika skepnader, kan ISH användas för att spatialt lokalisera specifika loci på kromosomerna, rRNA, mRNA och mikro RNA.
En av de utmaningar som vi behövde för att ta itu med innan förfina en WMISH metod för L. stagn var frågan om försiktigt och effektivt extrahera embryon och larver av olika stadier från than ägg kapslar, i vilka de är avsatta. Denna extraktion, eller "decapsulation ', behöver uppnås effektivt i syfte att samla in tillräckligt material för en given in situ experiment, medan på samma gång bibehålla morfologiska och cellulär integritet. Medan andra modellorganismer genomgår också inkapslad utveckling, i våra händer inget av de metoder som rapporterats för dessa arter kan med framgång användas i L. stagn.
De övergripande målen med denna metod är därför: att extrahera L. stagn embryon och larver från deras kapslar i en hög genomströmning sätt, att tillämpa förhybridisering behandlingar som optimerar WMISH signalen, för att förbereda embryon och larver med tillfredsställande WMISHsignals för avbildning.
Den metod som beskrivs här möjliggör effektiv visualisering av RNA-transkript med förmodligen varierande uttrycksnivåer inom alla utvecklingsstadier av lymnaea stagn. För att ta bort embryon och larver från deras kapslar vi provat en mängd olika kemiska, osmotisk chock och fysiska behandlingar rapporterats för andra encapsulated- utveckla modellorganismer. Men i våra händer den metod vi beskriver här är den enda hög genomströmning teknik som tar bort den hårda kapselmembranet utan att skada de e…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av finansiering till DJJ genom DFG projekt # JA2108 / 2-1.
Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION – May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION – CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION – ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION – Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION – CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION – Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION – Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION – May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION – Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION – May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION – Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION – May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |