A Whole Dağı<em> In Situ</emGastropoda yumuşakça için> Hibridizasyon Yöntemi<em> Lymnaea stagnalis</em
Summary
The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.
Abstract
In situ hibridizasyon bütün montaj (WMISH) ilgili (örneğin, bir embriyo veya larva gibi) bir "bütün montaj 'doku terkibi olan bir nükleik asit molekülü (genellikle mRNA'lar) uzamsal çözünürlük veya gelişimsel aşamada sağlayan bir tekniktir. önemli ölçüde karmaşık metazoan genomları fonksiyonel karakterizasyonu, yeni nesil dizi verilerinin tufan ile bir darboğaz haline gelmektedir bir meydan okuma katkıda bulunabilir çünkü WMISH son derece güçlüdür. çok zaman genellikle yeni model sistemler için WMISH deneylere doğasında çeşitli parametrelerini optimize için gereken tekniğin kavramsal basitliğine rağmen; doku tipleri ve gelişim aşamaları arasındaki hücresel ve biyokimyasal ince farklar tek WMISH yöntemi tüm durumlar için uygun olmayabilir anlamına gelir. Biz tutarlı üretmek ve yeniden ortaya çıkan gastropod modeli Lymnaea stagnalis için WMISH yöntemler kümesi geliştirdikgenlerin ve tüm gelişim aşamaları arasında bir aralık için açık WMISH işaretleri. Bu yöntemler, bir ontogenetik pencereye bilinmeyen kronolojik yaş larva atama, onların yumurta kapsüllerden verimli embriyoların kaldırılmasını ve larvaları, her ontogenetik pencere için uygun bir proteinaz-K tedavisinin uygulanmasını ve hibridizasyon sonrası hibridizasyon ve İmmuno dahil adımlar. Bu yöntemler, belirli bir RNA transkripti için ortaya çıkan sinyal prob özel ayarlamalar (öncelikle konsantrasyon ve melezleme sıcaklığı prob) ile daha da rafine olabilen bir zemin oluşturmaktadır.
Introduction
Yumuşakçalar bilimsel disiplinlerin geniş bir çeşitlilik ilgi tutmak hayvanların bir grup vardır. Morfolojik çeşitlilik 1 rağmen, tür, 3 ticari tıbbi 4 ve bilimsel konularda 5-8 geniş bir yelpazede ve alaka (tür sayısı 2 bakımından sadece Arthropodlara ikinci) zenginliği, iddia edebilir görece az sayıda yumuşakça türü vardır iyi donanımlı bilimsel model ve laboratuar ortamında bakımı kolay hem olacak. Çok böyle nörobiyoloji 9, ekotoksikoloji 10 ve daha yakın evrimsel biyoloji 11,12 olarak disiplinler tarafından kullanılan bir yumuşakça, öncelikle çünkü yaygın dağıtım ve bakım aşırı kolaylığı, Lymnaea stagnalis olduğunu. Bir 'model' organizma olarak popülerlik ve L. mevcut gelişimsel biyologlar 13-19, moleküler araçlar aralığı ve güç kullanımı onun uzun geçmişine rağmen stagnalis bilimsel topluluk çok daha geleneksel hayvan modellerinde (Drosophila, fare, deniz kestanesi, nematodlar) o arkasında yatıyor.
Bir moleküler modeli kabuk oluşumunu rehberlik moleküler mekanizmalar bir ilgi kaynaklanıyor gibi bizim arzu Lymnaea geliştirmektir. Bu Lymnaea 'ın gelişimi sırasında gen ifadesinin, verimli, tutarlı ve duyarlı görselleştirme için izin verecek teknikleri bir dizi rafine bizi motive etti. In situ hibridizasyon bütün montaj (WMISH) yaygın model organizmaların çeşitli kullanılır ve 40 yılı aşkın 20 kullanımda olmuştur. Farklı guises, ISH mekansal kromozomlar, rRNA, mRNA ve mikro-RNA'lar belirli loci lokalize etmek için kullanılabilir.
Zorluklardan biri, önceki L. için WMISH yöntemi rafine hitap için gerekli stagnalis nazikçe ve etkin ayıklanması embriyo ve t değişen aşamaları larvalarının sorun olduO depolandıkları yumurta kapsüller. Bu özütleme, ya da 'kapsülden çıkarma', yeterli malzeme toplamak için etkili bir şekilde elde edilmesi gerekmektedir, aynı zamanda, morfolojik ve hücresel bütünlüğü muhafaza edilirken, in situ deneyde verilen. Diğer model organizmalar da kapsüllü gelişime tabi iken, elimizde bu türler için bildirilen yöntemlerden hiçbiri başarılı L. istihdam edilebilir stagnalis.
Bu yöntemin genel amaçları bu nedenle: L. ayıklamak için stagnalis yüksek verimli bir şekilde kendi kapsüller, embriyolar ve larvalar görüntüleme için tatmin edici bir WMISHsignals embriyo ve larvaları hazırlamak için, WMISH sinyali iyileştirir ön hibridizasyon tedaviler uygulamak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen yöntem, Lymnaea stagnalis tüm gelişim aşamalarında olan muhtemelen farklı sentezleme seviyelerine sahip RNA transkriptlerinin etkin olarak gösterebilir. Onların kapsüller embriyolar ve larvaları çıkarmak için diğer encapsulated- için bildirilen kimyasal, ozmotik şok ve fiziksel tedaviler çeşitli trialed model organizmalar geliştirmek. Ancak, bizim elimizde biz burada açıklamak yöntemi embriyolar ve larvaları zarar vermeden sert kapsül zarı kaldırır sadece …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma DFG projesi # JA2108 / 2-1 ile DJJ için fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION – May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION – CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
| Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
| Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
| Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION – ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
| Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
| Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION – Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
| Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION – CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
| Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION – Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
| Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION – Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
| Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
| Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION – May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION – Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
| N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION – May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION – Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
| Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
| Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION – May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
References
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Brusca, R. C., Brusca, G. J. . Invertebrates. , (2002).
- World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
- Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).
- Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
- Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
- Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).
- Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).
- Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).
- Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15 (1), 19 (2015).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its’ chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).
- Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).
- Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
- Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183 (1), (1973).
- Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).
- Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35 (1), 29 (1973).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).
- Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).
- Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).
- Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7 (1), 160 (2007).
- Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
- Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. , (2015).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).
- Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
- Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).
- Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).
- Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).
- Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).
- Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).
- Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).
