Сочетание Double Флуорецсенция<em> В Ситу</em> Гибридизация с Immunolabelling для обнаружения экспрессии трех генов в мышином Срезы мозга
Summary
Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.
Abstract
Обнаружение экспрессии генов в различных типах клеток головного мозга , например, нейроны, астроциты, олигодендроциты, олигодендроцитов и микроглии предшественников, может быть затруднено из – за отсутствия конкретных первичных или вторичных антител для иммунологического окрашивания. Здесь мы опишем протокол для определения экспрессии трех различных генов в той же секции головного мозга с использованием двойной флуоресценции в гибридизация с двумя геноспецифических зондов с последующим иммунным окрашиванием с антителом высокой специфичностью , направленной против белка , кодируемого геном третьего. Aspartoacyclase (ООРА) генов, мутации которых могут привести к редкой человеческой болезни белой материи – болезнь Канавана – Считается , что выражается в олигодендроцитов и микроглии , но не в астроциты и нейроны. Тем не менее, до сих пор не установлена точная картина экспрессии ASPA в головном мозге. Этот протокол позволил нам определить, что ООРА выражается в субпопуляции зрелых олигодендроцитов ае он может быть как правило, применяется к широкому спектру исследований характера экспрессии генов.
Introduction
Глиальные клетки, которые являются наиболее распространенными клеток в центральной нервной системе (ЦНС), включают в себя олигодендроцитов (в myelinating клетки центральной нервной системы), олигодендроциты предшественники (OPS, также известные как "NG2 клетки"), астроциты и микроглии. Существует растущий интерес к функции глиальных клеток и их потенциальной роли в неврологических заболеваний 1. Например, болезнь Канавана (CD) является наследственным нейродегенеративным заболеванием начиная с раннего детства с губчатой Leukodystrophy и прогрессирующей потерей нейронов, что приводит к смерти , как правило , до 10 лет , 2,3. Мутации в гене Aspartoacyclase (ООРА) , которые приводят к значительно сниженную активность ASPA 4 в КР были идентифицированы. ООРА представляет собой фермент , катализирующий деацетилирование N-ацетиласпартата (НАА), молекула высоко концентрированным в головном мозге, генерируя ацетат и аспартат 5-7. Многие пациенты CD показывают более высокие уровни NAA из-за отсутствия ООРА переменного токательность. Некоторые исследования предполагают , что НАА полученный ацетат может быть основным источником жирных кислот / липидов в головном мозге в процессе разработки и CD могут возникнуть в результате снижения синтеза миелина в процессе развития , вызванного отказом НАА быть разбиты 3,5,6.
ООРА встречается преимущественно в почках, печени и белого вещества головного мозга, а также учитывая важную роль в ООРА CD, сотовая экспрессия этого фермента в мозге было изучено несколько лабораторий. Глядя на ферментативную активность ООРА в головном мозге, более ранние исследования показали , что увеличение активности ООРА во время развития мозга параллельно временной ход миелинизации 8-10. На клеточном уровне, анализы для ферментативной активности, а также в гибридизация (МОГ) и иммуногистохимии (IHC) , в анализ позволяет предположить , что ООРА в основном экспрессируется в олигодендроциты в головном мозге , но не в нейронах или астроцитов 11-16. Несколько исследований показали, что ООРА может такжевыражается в микроглии в центральной нервной системе 12,14. До сих пор данные по экспрессии ООРА в ФОС ограничены. Согласно данным недавнего исследования , где Транскриптом различных типов клеток в коре головного мозга мыши , включая нейроны, астроциты, ФОС, новообразованных олигодендроцитов, myelinating олигодендроцитов, микроглии, эндотелиальные клетки, и перицитами анализировали с помощью РНК секвенирования 17, экспрессируется исключительно ООРА в олигодендроциты , в частности, в myelinating олигодендроциты (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Несмотря на эти исследования по ООРА паттерна экспрессии в головном мозге, ряд неопределенностей, остаются.
Различные методы могут быть использованы для изучения паттернов экспрессии генов. IHC является широко используемый метод для определения функционального продукта (т.е. белок) генной экспрессии в срезах ткани. Несмотря на большую полезность, этот метод имеет свои ограничения, как его применение и специфичность могут быть тО наличии и специфичности антитела необходимо. Для сравнения, ISH имеет то преимущество, которое позволяет выявить экспрессию любого гена на уровне мРНК. Тем не менее, это может быть технически сложно использовать несколько зондов в то же время для того, чтобы локализовать экспрессию генов в специфических типах клеток. В этой статье мы опишем протокол сочетающую двойной РНК флуоресцентной гибридизации de – situ с флуоресцентной immunolabelling белка. Мы использовали этот набор методов для изучения характера экспрессии Aspa в мозге мыши. Этот метод позволяет точно Изучение экспрессии генов с использованием конфокальной микроскопии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол предусматривает процедуру шаг за шагом для двойной РНК гибридизация с последующим иммунным окрашиванием. Мы использовали этот протокол для подтверждения того, что Aspa выражается в зрелых олигодендроцитов в нескольких областях мозга.
Эта процеду…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the authors’ laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, “Ideas” Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.
Materials
| QIAprep® Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65°C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
References
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D’Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
