De combinatie van Double Fluorescentie<em> In Situ</em> Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties
Summary
Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.
Abstract
Detectie van genexpressie in verschillende hersencellen bijvoorbeeld neuronen, astrocyten, oligodendrocyten, oligodendrocyt voorlopers en microglia, kan worden belemmerd door het gebrek aan specifieke primaire of secundaire antilichamen voor immunokleuring. Hier beschrijven we een protocol voor de expressie van drie verschillende genen in dezelfde hersenpreparaat met dubbelzijdige fluorescentie in situ hybridisatie detecteren met twee genspecifieke probes, gevolgd door immunokleuring met een antilichaam met hoge specificiteit die is gericht tegen het eiwit dat wordt gecodeerd door een derde gen. De Aspartoacyclase (ASPA) gen, mutaties die leiden tot een zeldzame menselijke wittestofziekte – ziekte Canavan – wordt gedacht te worden uitgedrukt in oligodendrocyten en microglia, maar niet in astrocyten en neuronen. De precieze expressiepatroon van ASPA in de hersenen nog niet vastgesteld. Dit protocol heeft ons in staat gesteld om te bepalen dat ASPA wordt uitgedrukt in een subset van volwassen oligodendrocyten eennd kan algemeen worden toegepast op een breed scala van genexpressiepatroon studies.
Introduction
Gliacellen, die de meest voorkomende cellen in het centrale zenuwstelsel (CNS) zijn, omvatten oligodendrocyten (de myeliniserende cellen van CNS), oligodendrocyten precursors (OP's, ook bekend als "NG2 cellen"), astrocyten en microglia. Er is toenemende interesse in de functies van gliacellen en hun potentiële rol bij neurologische aandoeningen 1. Bijvoorbeeld, ziekte van Canavan (CD) is een erfelijke neurodegeneratieve aandoening de aanvang van de kinderjaren met spongiforme leukodystrofie en een progressief verlies van neuronen, wat leidt tot de dood gewoonlijk voor 10 jaar 2,3. Mutaties in de Aspartoacyclase (ASPA) gen die leiden drastisch verminderde activiteit ASPA 4 CD geïdentificeerd. ASPA is een enzym katalyseert de deacetylering van N-acetylaspartate (NAA), een molecuul sterk geconcentreerd in de hersenen, het genereren acetaat en aspartaat 5-7. Veel cd patiënten vertonen hogere NAA door gebrek aan ASPA acteit. Sommige studies speculeren dat NAA-afgeleide acetaat een belangrijke bron van vetzuren / lipiden in de hersenen tijdens de ontwikkeling zou kunnen zijn en CD gevolg kunnen zijn van verminderde myeline synthese tijdens de ontwikkeling veroorzaakt door het falen van NAA worden afgebroken 3,5,6.
ASPA wordt vooral aangetroffen in de nieren, de lever en witte stof van de hersenen, en gezien de belangrijke rol van ASPA in CD, heeft de cellulaire expressie van dit enzym in de hersenen bestudeerd door verschillende laboratoria. Door te kijken naar ASPA enzymatische activiteit in de hersenen, eerdere studies bleek dat de toename van ASPA activiteit tijdens hersenontwikkeling loopt parallel met het tijdsverloop van myelinisatie 8-10. Op cellulair niveau assays voor enzymactiviteit als in situ hybridisatie (ISH) en immunohistochemie (IHC) analyses blijkt dat ASPA vooral uitgedrukt in oligodendrocyten in de hersenen, maar niet in neuronen en astrocyten 11-16. Een paar studies bleek dat ASPA zou ookuitgedrukt in microglia in het CZS 12,14. Tot nu toe gegevens over ASPA meningsuiting in OP's zijn beperkt. Volgens een recente studie waarin transcriptomes verschillende celtypen bij muizen cerebrale cortex inclusief neuronen, astrocyten, OP's, nieuw gevormde oligodendrocyten, myeliniserende oligodendrocyten, microglia, endotheelcellen en pericyten werden geanalyseerd door RNA sequentie 17 wordt ASPA uitsluitend uitgedrukt in oligodendrocyten , in het bijzonder in myelinating oligodendrocyten (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Ondanks deze studies ASPA expressiepatroon in de hersenen, een aantal onzekerheden blijven.
Verschillende technieken kunnen worden gebruikt om genexpressie patronen bestuderen. IHC is een algemeen gebruikte werkwijze voor het detecteren van functionele product (dwz eiwit) van genexpressie in weefselcoupes. Ondanks zijn grote nut, deze techniek heeft beperkingen als de toepassing ervan en specificiteit zijn afhankelijk van to de beschikbaarheid en specificiteit van het antilichaam nodig is. Ter vergelijking, ISH heeft het voordeel dat de expressie van elk gen onthullen op het mRNA-niveau. Het kan echter technisch moeilijk om meerdere probes tegelijkertijd om een genexpressie tot specifieke celtypen te lokaliseren. In dit artikel beschrijven we een protocol combineert dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie met fluorescentie immunolabel van een eiwit. We hebben deze set van technieken die worden gebruikt om de expressie patroon van Aspa in muizenhersenen te onderzoeken. Deze methode kan de precieze studie van genexpressie met behulp van confocale microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol wordt stap-voor-stap procedure voor een dubbele RNA in situ hybridisatie gevolgd door immunokleuring. We hebben dit protocol dat wordt gebruikt om te bevestigen dat Aspa wordt uitgedrukt in mature oligodendrocyten in verschillende hersengebieden.
Deze multi-step procedure vele valkuilen die gevoeligheid kan beïnvloeden en moeten worden vermeden. Ten eerste, alle oplossingen en buffers voor opslag transcriptiereactie nodig RNase-vrij zijn. Ten tweede, de keuze …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the authors’ laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, “Ideas” Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.
Materials
| QIAprep® Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65°C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
References
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D’Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
