Kombinere Double Fluorescence<em> In Situ</em> Hybridisering med immunomerking for Påvisning av Expression of Three Gener i musehjerne §§
Summary
Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.
Abstract
Påvisning av genuttrykk i forskjellige typer hjerneceller for eksempel, nevroner, astrocytter oligodendrocytes, oligodendrocyte forløpere og microglia, kan bli hemmet av mangel på spesifikke primære eller sekundære antistoffer for immunfarging. Her beskriver vi en protokoll for å påvise ekspresjon av tre forskjellige gener i den samme hjernen delen ved å bruke dobbel fluorescens in situ hybridisering med to genspesifikke prober, etterfulgt av farging med et antistoff med høy spesifisitet rettet mot proteinet kodet for av en tredje genet. Den Aspartoacyclase (ASPA) genet, mutasjoner av noe som kan føre til en sjelden human hvit substans sykdom – Canavan sykdom – antas å bli uttrykt i oligodendrocytter og mikroglia, men ikke i astrocytter og nevroner. Har imidlertid ennå ikke etablert nøyaktig uttrykk mønster av ASPA i hjernen. Denne protokollen har tillatt oss å fastslå at Aspa er uttrykt i en undergruppe av moden oligodendrocytes ennd det kan generelt anvendes på et bredt spekter av genuttrykksmønstrene studier.
Introduction
Gliaceller, som er de mest tallrike cellene i sentralnervesystemet (CNS), omfatter oligodendrocytter (de myelinerende celler av CNS), oligodendrocytter forløpere (OPS, også kjent som "NG2 celler"), astrocytter og microglia. Det er økende interesse for funksjonene til gliacellene og deres potensielle roller i nevrologiske sykdommer 1. For eksempel Canavan sykdom (CD) er en arvelig nevrodegenerativ lidelse starter tidlig barndom med spongiform leukodystrophy og et progressivt tap av nerveceller, som fører til døden vanligvis før 10 års alder 2,3. Mutasjoner i Aspartoacyclase (ASPA) genet som fører til drastisk redusert aktivitet ASPA 4 i CD har blitt identifisert. ASPA er et enzymet som katalyserer deacetyleringen av N-acetylaspartate (NAA), et molekyl som sterkt konsentrert i hjernen, genererer acetat og aspartat 5-7. Mange CD-pasienter viser høyere nivåer av NAA grunn av mangel på Aspa activitet. Noen studier spekulerer i at NAA-avledet acetat kan være en viktig kilde av fettsyrer / lipider i hjernen under utvikling og CD kan være resultatet av redusert myelin syntese under utvikling som skyldes svikt i NAA å bli brutt ned 3,5,6.
ASPA hovedsakelig funnet i nyre, lever og hvit substans i hjernen, og gitt den viktige rollen ASPA i CD, har den cellulære ekspresjon av dette enzym i hjernen blitt studert av flere laboratorier. Ved å se på Aspa enzymatisk aktivitet i hjernen, tidligere studier har funnet at økningen i Aspa aktivitet under hjernens utvikling paralleller tidsforløpet av myelination 8-10. På cellenivå, analyser analyser for enzymatisk aktivitet, så vel som in situ hybridisering (ISH) og immunhistokjemi (IHC) antyder at ASPA er hovedsakelig uttrykt i oligodendrocytter i hjernen, men ikke i neuroner eller astrocytter 11-16. Noen studier har funnet at Aspa kanskje ogsåuttrykkes i mikroglia i sentralnervesystemet 12,14. Så langt data på Aspa uttrykk i OPS er begrenset. Ifølge en fersk studie der transcriptomes av ulike celletyper i musen hjernebarken inkludert nevroner, astrocytter, ops, nydannede oligodendrocytes, myelinerende oligodendrocytter, microglia, endotelceller, og pericytes ble analysert ved RNA sekvense 17, Aspa utelukkende uttrykt i oligodendrocytes , spesielt i myelinerende oligodendrocytter (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Til tross for disse studiene på Aspa uttrykk mønster i hjernen, en rekke usikkerheter forbli.
Forskjellige teknikker kan brukes til å studere genuttrykksmønster. IHC er en vanlig brukt metode for å påvise den funksjonelle produkt (dvs. protein) av en genekspresjon i vevssnitt. Til tross for sin flotte verktøyet, har denne teknikken begrensninger som sin søknad og spesifisitet er under to tilgjengeligheten og spesifisiteten av antistoffet er nødvendig. Til sammenligning har ISH fordelen av å være i stand til å avsløre ekspresjon av hvilket som helst gen på mRNA-nivå. Men det kan være teknisk vanskelig å benytte flere prober samtidig for å lokalisere en genekspresjon til spesifikke celletyper. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll som kombinerer dobbel fluorescens RNA in situ hybridisering med fluorescens immunomerking av et protein. Vi har brukt dette sett av teknikker for å undersøke ekspresjon mønster av Aspa i musehjerne. Denne metoden gir den nøyaktige studier av genekspresjon ved hjelp av konfokal mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen gir en trinn-for-trinn fremgangsmåte for en dobbel RNA in situ-hybridisering, etterfulgt av immunfarging. Vi har brukt denne protokollen til å bekrefte at Aspa er uttrykt i modne oligodendrocytter i flere hjerneområder.
Denne multi-trinns prosedyre har mange potensielle fallgruver som kan påvirke følsomhet og bør unngås. Først må alle løsninger og lagringsbuffere for transkripsjonsreaksjon må være RNase-fri. For det andre er valget av cDNA temp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the authors’ laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, “Ideas” Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.
Materials
| QIAprep® Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65°C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
References
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D’Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
